基于牙髓干細(xì)胞的神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療新進(jìn)展

程晨 彭杉 楊桐 綜述 丁剛 審校

中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)共同傳輸和處理感官信息，并控制和調(diào)節(jié)各系統(tǒng)器官的活動(dòng)。創(chuàng)傷、腦缺血、神經(jīng)退行性疾病等可以導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥、軸突變性、神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)畸形甚至死亡，嚴(yán)重影響患者身體健康和生活質(zhì)量。由于神經(jīng)前體細(xì)胞數(shù)量有限[1-3]，傳統(tǒng)的治療方法在神經(jīng)元功能恢復(fù)方面療效有限。干細(xì)胞是一類具有自我更新和高度分化潛能的細(xì)胞，能夠分化為各種類型的功能細(xì)胞，基于干細(xì)胞的治療策略為神經(jīng)再生和修復(fù)提供了新的手段。其中，來源于神經(jīng)嵴的牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)具有神經(jīng)分化的潛能，在一定條件下，能被誘導(dǎo)成神經(jīng)元或神經(jīng)樣細(xì)胞，并且能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷提供了可能[4]。

1 DPSCs特性

1.1 DPSCs的培養(yǎng)

2000 年Gronthos等[5]首先從牙髓組織中分離并鑒定DPSCs，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有相似免疫表型，能夠自我更新和多向分化，具有較高的細(xì)胞增殖率和克隆形成能力。DPSCs一般分離自正常的阻生第三磨牙或者正畸減數(shù)牙，且多采用酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)[5-6]。

1.2 DPSCs的神經(jīng)特性

DPSCs來源于顱神經(jīng)嵴，可以在體外誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞，具有類似功能神經(jīng)元的特征，比其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)大的神經(jīng)分化潛力[7-8]。Gonmane等[9]將DPSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)前體細(xì)胞，與包含耳蝸核的聽覺腦干切片共培養(yǎng)，其神經(jīng)元分化的特異性標(biāo)記物原肌球蛋白受體激酶、GATA結(jié)合蛋白3及突觸小泡蛋白高表達(dá)，并表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)鈣震蕩，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自體DPSCs為感音神經(jīng)性聽力損失患者提供了新的治療方法[9]。另有研究證明，DPSCs可以通過形成神經(jīng)球而分化為多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，為治療帕金森病提供了可能[10]。與骨髓和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞相比，DPSCs在體內(nèi)外具有更高的增殖率，高表達(dá)并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，表現(xiàn)出更優(yōu)異的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)支持特性[11-12]。Geng等[13]研究者用白藜蘆醇處理DPSCs，并與在神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的DPSCs比較，發(fā)現(xiàn)兩組DPSCs的神經(jīng)元特異性標(biāo)記物(巢蛋白和神經(jīng)絲蛋白)的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均上調(diào)，表明白藜蘆醇具有與神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基相近的誘導(dǎo)DPSCs 神經(jīng)元向分化作用。隨著人們對(duì)DPSCs的深入研究，越來越多的臨床前動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證明DPSCs在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有顯著療效，DPSCs可以在適當(dāng)?shù)臈l件下分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并且分化的細(xì)胞表現(xiàn)出典型的電生理特性[14-15]。與之相反的是，胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷方面的證據(jù)尚不夠充分[16]，且存在腫瘤形成、免疫排斥、倫理爭(zhēng)議等問題[17], 因此DPSCs是一個(gè)促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和保護(hù)神經(jīng)特性的良好細(xì)胞來源。

2 DPSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果

多種體外、體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)證明，DPSCs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有良好的治療作用(表1)。

2.1 腦中風(fēng)

Nito等[18]將DPSCs注入大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型，發(fā)現(xiàn)DPSCs顯著抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，腦梗塞面積明顯減少，運(yùn)動(dòng)功能障礙得到逆轉(zhuǎn)，皮質(zhì)缺血邊界區(qū)域的神經(jīng)元變性明顯減輕。另有研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶和轉(zhuǎn)化生長因子β信號(hào)通路參與了DPSCs介導(dǎo)的腦中風(fēng)治療，且DPSCs的治療作用強(qiáng)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[19]。Kota等[20]使用過表達(dá)肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的DPSCs治療大腦中動(dòng)脈阻塞的大鼠，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HGF增強(qiáng)了DPSCs缺血/再灌注后腦損傷的治療作用，顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎性因子表達(dá)和神經(jīng)元變性，減少腦梗塞面積，改善運(yùn)動(dòng)功能。再灌注后，過表達(dá)HGF的DPSCs能增加緊密連接蛋白，維持血腦屏障的完整性，并增加腦梗塞周圍區(qū)域的微血管密度。Chiu等[21]將免疫分選的胰島素樣生長因子1受體陽性(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)的DPSCs移植到缺血缺氧性腦病新生大鼠的腦中，發(fā)現(xiàn)DPSCs能夠神經(jīng)向分化，誘導(dǎo)神經(jīng)突的再生，改善大鼠的神經(jīng)行為，促進(jìn)神經(jīng)的可塑性和神經(jīng)功能恢復(fù)。此外，有研究者將DPSCs衍生的神經(jīng)球細(xì)胞移植入重度前腦缺血性損傷的大鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)DPSCs能提供神經(jīng)保護(hù)作用，腦缺血顯著改善，海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞死亡減少，提高了動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能、認(rèn)識(shí)功能和總體生存率[22]。Nagpal等[23]主持了自體DPSCs治療慢性中風(fēng)患者的安全性和可行性的臨床研究，不過最終結(jié)果尚未報(bào)道。

2.2 帕金森病

帕金森病(parkinson disease，PD)是一種常見的錐體外系變性疾病，主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的早期凋亡，臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)障礙、僵硬和靜息性震顫。因?yàn)槠渖窠?jīng)嵴來源、免疫調(diào)節(jié)作用、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、誘導(dǎo)軸突導(dǎo)向(axon guidance)、分化為功能性神經(jīng)元等特性，DPSCs可成為PD治療的細(xì)胞來源，為基于干細(xì)胞移植的PD治療提供一種比較可靠的途徑，在PD治療中有潛在的應(yīng)用價(jià)值[24]。Fujii等[25]將人脫落乳牙來源的DPSCs移植入6-羥基多巴胺(6-Hydroxydopamine ,6-OHDA)誘導(dǎo)的大鼠PD模型中，發(fā)現(xiàn)DPSCs主要通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)PD大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，增加多巴胺水平，增強(qiáng)了內(nèi)源性多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)了黑質(zhì)紋狀體的恢復(fù)。另有研究用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine , MPTP)誘導(dǎo)PD體外模型，與DPSCs在Transwell條件下共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)DPSCs能減少該模型活性氧和一氧化氮產(chǎn)生，減輕DNA損傷，抑制促炎因子的表達(dá)，在PD體外模型的治療中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)的作用[26]。Chen等[27]將DPSCs條件培養(yǎng)基經(jīng)尾靜脈注入魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠PD模型，發(fā)現(xiàn)能夠改善PD癥狀，增加紋狀體酪氨酸羥化酶的表達(dá)，降低黑體和紋狀體的α-突觸核蛋白水平，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DPSCs條件培養(yǎng)基的治療作用是通過調(diào)節(jié)膽堿能突觸、鈣信號(hào)通路和血清素能突觸來實(shí)現(xiàn)的。

2.3 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)是常見的神經(jīng)退行性疾病之一，臨床表現(xiàn)主要為癡呆和智力下降，主要病理變化為β-淀粉樣肽沉積和Tau蛋白磷酸化[28]。Wang等[29]用大田軟海綿酸作用于人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y)來制備AD細(xì)胞模型，然后將DPSCs與AD細(xì)胞模型進(jìn)行Transwell共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AD體外模型的細(xì)胞活力升高、凋亡減少，收縮的樹突重現(xiàn)再拉長，微絲緊密排列，微管纖維增厚，Tau蛋白的Ser 396磷酸化顯著受到抑制。另有研究顯示DPSCs分泌血管內(nèi)皮生長因子、單核細(xì)胞趨化蛋白1、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等細(xì)胞因子，顯著降低β-淀粉樣肽的細(xì)胞毒性，刺激凋亡抑制因子Bcl-2的生成，并降低凋亡促進(jìn)因子Bax，從而使細(xì)胞凋亡減少，說明DPSCs有望成為治療AD的候選藥物[30]。Zhang等[31]將淀粉樣蛋白-β1-42注入大鼠海馬回制備AD模型，然后把DPSCs注射入海馬回，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元相關(guān)的雙皮質(zhì)素、特異性核抗原蛋白和神經(jīng)絲蛋白200表達(dá)升高，β-淀粉樣肽水平降低，且動(dòng)物的認(rèn)知能力和行為能力顯著地改善，作者認(rèn)為DPSCs通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元相關(guān)蛋白的分泌改善了AD的癥狀。

2.4 肌萎縮性側(cè)索硬化癥

肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行性丟失為特征的一種神經(jīng)系統(tǒng)變性病，涉及中樞神經(jīng)膠質(zhì)與周圍免疫反應(yīng)和神經(jīng)肌肉接頭之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系。研究者將DPSCs條件培養(yǎng)基注射到mSOD1G93AALS小鼠動(dòng)物模型的腹腔內(nèi)，結(jié)果顯示，無論在疾病的哪個(gè)階段注射DPSCs條件培養(yǎng)基，都能明顯促進(jìn)神經(jīng)肌肉接頭部位的神經(jīng)支配，防止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失并延長了動(dòng)物的壽命，而灰質(zhì)前角部位的反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)分裂并不受影響。關(guān)于DPSCs治療ALS的機(jī)制，作者考慮與DPSCs分泌的各種因子對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體和神經(jīng)肌肉接頭部位的神經(jīng)營養(yǎng)作用有關(guān)[32]。

2.5 脊髓損傷

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是脊柱損傷中最嚴(yán)重的并發(fā)癥，在損害的相應(yīng)節(jié)段出現(xiàn)各種運(yùn)動(dòng)、感覺和括約肌功能障礙，肌張力異常等的相應(yīng)改變。脊髓損傷不僅給患者本人帶來身心的嚴(yán)重傷害，而且對(duì)社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。一項(xiàng)體內(nèi)研究試驗(yàn)表明，將DPSCs注入完全橫斷的大鼠脊髓模型，發(fā)現(xiàn)DPSCs能減少炎癥性損傷，促進(jìn)軸突再生，并減少SCI后的進(jìn)行性出血性壞死，且有部分DPSCs在體內(nèi)存活并分化為成熟神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)了SCI鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。至于相關(guān)機(jī)制，作者認(rèn)為與DPSCs抑制白細(xì)胞介素-1β、Ras Homolog基因家庭成員A和磺酰脲受體1的表達(dá)相關(guān)[33]。另有研究表明，將預(yù)先血管化的DPSCs植入大鼠受損的脊髓中，可以促進(jìn)血運(yùn)重建及軸突再生，恢復(fù)髓磷脂蛋白的沉積和感覺功能，具有血管生成和神經(jīng)營養(yǎng)潛力，對(duì)SCI具有明顯的改善和調(diào)節(jié)作用，DPSCs的促血管形成和神經(jīng)營養(yǎng)特性發(fā)揮了主要作用[34]。Zhang等[35]將DPSCs與殼聚糖支架復(fù)合，然后移植到SCI大鼠，發(fā)現(xiàn)顯著促進(jìn)了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3的分泌，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)了DPSCs的治療作用。

2.6 周圍神經(jīng)損傷

DPSCs可作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程的人工神經(jīng)。在一項(xiàng)研究中，將兔的DPSCs注入兔面神經(jīng)損傷處，明顯改善了面神經(jīng)功能的恢復(fù)，兔再生神經(jīng)纖維數(shù)量增多，纖維直徑和髓鞘厚度增加，其修復(fù)機(jī)制可能與神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)上調(diào)有關(guān)[36]。研究者制備大鼠面神經(jīng)擠壓傷模型，并局部注射DPSCs，14 d后大鼠的耳語動(dòng)作恢復(fù)，組織學(xué)檢查顯示，軸突變性和無髓鞘軸突減少，神經(jīng)纖維脫髓鞘減少，髓鞘排列規(guī)則，研究者認(rèn)為神經(jīng)生長因子發(fā)揮了重要作用[37]。研究者將DPSCs輸入大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型，發(fā)現(xiàn)DPSCs可以遷移到神經(jīng)缺損處，并表達(dá)施萬細(xì)胞的標(biāo)記物 S1 00b，移植后1 個(gè)月可見顯著的軸突再生[38]。

研究者用鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，48 周后，將DPSCs注射到動(dòng)物后肢的骨骼肌處(共10個(gè)注射點(diǎn))。注射4 周后，局部的運(yùn)動(dòng)/感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯加快，電流感覺閾值降低，骨骼肌毛細(xì)血管密度增加，表皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度增加，髓磷脂厚度增加，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)突外伸生長明顯，施萬細(xì)胞的髓磷脂相關(guān)蛋白表達(dá)升高，DPSCs通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子改善了糖尿病引起的神經(jīng)病理學(xué)改變[39]。

3 總 結(jié)

綜上所述，DSPCs作為組織工程的種子細(xì)胞來源具有較多優(yōu)勢(shì)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的修復(fù)和再生方面有良好的應(yīng)用前景，但是將DPSCs 用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療仍面臨很大的挑戰(zhàn)：(1)目前仍然沒有得到一致認(rèn)可的DPSCs體外神經(jīng)誘導(dǎo)分化方案；(2)目前絕大多數(shù)研究主要是利用體外模型和嚙齒類動(dòng)物模型，在大動(dòng)物模型的研究較少；(3)DSPCs能分泌多種生物活性因子，這些生物活性因子相互作用且作用復(fù)雜，它們?cè)贒SPCs介導(dǎo)的神經(jīng)修復(fù)與再生方面發(fā)揮的作用尚不明確；(4) DSPCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)作用機(jī)制的研究較少，且機(jī)制不明確。只有這些問題有了滿意的答案，才能夠進(jìn)行下一步臨床研究，DSPCs才能安全、有效地治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。