中藥通過調(diào)控線粒體自噬保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展#

文靜 李智 張建武 牛娜△

（1.川北醫(yī)學(xué)院藥理教研室，四川 南充，637100；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 南充 637100）

缺血性心臟病是全球死亡率最高的疾病之一，目前，利用手術(shù)和藥物快速有效地恢復(fù)冠脈血流是治療缺血性心血管病的主要方法，在心梗后血運重建、冠脈溶栓、冠脈支架植入術(shù)、冠脈搭橋術(shù)、心肺復(fù)蘇及休克后，均有可能出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），進(jìn)一步誘發(fā)心肌功能障礙，臨床亟需新的治療方法和預(yù)防手段。

研究顯示，缺血再灌注損傷心肌可占全部梗死心肌面積的50%[1]。目前公認(rèn)的MIRI 有4 種表現(xiàn)形式：再灌注誘發(fā)的心律失常、心肌頓抑、微血管阻塞、致死性心肌再灌注損傷，其中前兩種表現(xiàn)形式是可逆的，而后兩種是不可逆的[2]。因此，目前MIRI 已成為患者從缺血后復(fù)流獲益的主要障礙，如何預(yù)防和減少再灌注損傷是臨床上亟待解決的問題。

心血管系統(tǒng)的細(xì)胞和組織對能量要求較高，而線粒體是介導(dǎo)能量生成的主要細(xì)胞器，線粒體自噬是特異性清除受損線粒體的一種選擇性自噬，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。近年來研究表明，線粒體自噬在缺血性心臟疾病中起著重要作用。中醫(yī)藥在防治心血管疾病方面療效顯著，實驗研究也越來越深入，很多中藥及復(fù)方的作用機(jī)制得到闡明。本文就近幾年報道可通過調(diào)控線粒體自噬途徑保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的中藥及復(fù)方進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供新的研究方向。

1 線粒體自噬

線粒體是介導(dǎo)能量生成、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的主要細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要場所，其形態(tài)與數(shù)量、合成和降解均受到精確的調(diào)控。線粒體自噬作為特異性清除受損線粒體的一種選擇性自噬，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和各種生理過程中發(fā)揮重要作用[3]。線粒體自噬受多種因素的調(diào)控，在正常情況下，細(xì)胞通過自噬來清除受損或功能障礙的線粒體，但是當(dāng)線粒體自噬過程受阻或過度自噬時會導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。因此線粒體自噬必須保持一定程度上的平衡，自噬不足或過度都可能導(dǎo)致細(xì)胞走向死亡，從而加速疾病進(jìn)程。

線粒體自噬的整個過程可大致分為3 個步驟：①線粒體受到損傷后膜通透性發(fā)生改變，膜電位降低導(dǎo)致線粒體去極化，激活線粒體自噬相關(guān)蛋白；②自噬體包裹并隔離受損線粒體，形成線粒體自噬體；③線粒體自噬體與溶酶體融合形成線粒體自噬溶酶體，然后在酸性環(huán)境下降解內(nèi)容物[5]。目前已知主要有三條通路可調(diào)控線粒體自噬，即 PINK1/Parkin 通路、BNIP3/NIX 通路和FUNDC1 通路[6]。

1.1 PINK1/Parkin 通路

PINK1-Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬是哺乳動物細(xì)胞線粒體自噬最常見的方式，也是目前研究最清楚的一條通路[7]。PINK1（PTEN induced putative kinase 1）作為一種廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在正常生理情況下，PINK1 通過線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白（Translocator inner membrane，TIM）和線粒體外膜轉(zhuǎn)運蛋白（Translocator outer membrane，TOM）轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜。在線粒體內(nèi)膜上，被基質(zhì)加工肽酶（Matrix processing peptidase，MPP）剪切氨基端線粒體靶向序列。早老素相關(guān)菱形蛋白（Presenilin associated rhomboid likeprotein，PARL）剪切PINK1 的氨基酸A103 至F104 跨線粒體內(nèi)膜的疏水序列，導(dǎo)致在胞質(zhì)中的PINK1 被泛素蛋白酶體系快速降解[8]。因此PINK1 在細(xì)胞內(nèi)維持低水平。但在MIRI 等病理條件下，ROS 會損傷線粒體，受損的線粒體因缺乏電子傳遞導(dǎo)致膜電位下降或者未折疊蛋白反應(yīng)將PINK1 轉(zhuǎn)運至線粒體外膜，從而逃避PARL 的剪切和蛋白降解。PINK1 聚集在功能失調(diào)的線粒體外膜上，此時PINK1 會改變泛素分子，改變的泛素隨后會招募Parkin 到受損的線粒體上，通過對Parkin 和泛素磷酸化激活Parkin E3 連接酶活性。然后，Parkin 泛素化線粒體外膜融合蛋白1（Mitofusin 1，MFN1）和線粒體外膜融合蛋白2（Mitofusin 2，MFN2）等使線粒體泛素化。隨后泛素化的蛋白被自噬受體蛋白OPTN、P62、NDP52 等識別。同時，微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和自噬體膜也被募集到受損線粒體周圍，與自噬受體結(jié)合并吞噬受損的線粒體形成自噬體，隨后在溶酶體內(nèi)降解受損的線粒體。PINK1 和Parkin 位于同一條通路的上下游，協(xié)同介導(dǎo)了線粒體的自噬。

1.2 BNIP3/NIX 通路

BNIP3/NIX 與P62 相似，具有LIR 模體，可與LIR 結(jié)合作為自噬受體誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。目前研究表明BNIP3 和LC3 直接相互作用，介導(dǎo)了線粒體自噬的發(fā)生[9]。BNIP3 和NIX 在蛋白序列上具有同源性，但在線粒體自噬過程中BNIP3和NIX 的表現(xiàn)略有不同，在哺乳動物紅細(xì)胞分化過程中發(fā)生的線粒體自噬是由NIX 介導(dǎo)的，而在低氧條件下線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的選擇性清除是由BNIP3 介導(dǎo)的。

1.3 FUNDC1 通路

FUNDC1 是僅位于線粒體外膜的蛋白，在正常情況下，F(xiàn)UNDC1 能被蛋白激酶Src 磷酸化，而磷酸化的FUNDC1 和LC3 的相互作用比較弱，F(xiàn)UNDC1 的功能受到抑制，因此FUNDC1 能穩(wěn)定存在于線粒體外膜而不介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。在低氧的情況下，蛋白激酶Src 的活性降低，導(dǎo)致FUNDC1 磷酸化水平的降低，從而促進(jìn)其與LC3 相互作用和線粒體自噬的發(fā)生。FUNDC1 的18 位酪氨酸磷酸化是線粒體自噬的分子開關(guān)。

2 中醫(yī)理論下心肌缺血與線粒體自噬

中醫(yī)理論認(rèn)為，心主血脈，血脈瘀阻則會出現(xiàn)胸痹、心悸等癥狀，故缺血性心臟病在中醫(yī)常歸屬于“胸痹、心痛、真心痛、厥心痛”等范疇。其病癥最早記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》：“脈虛則血虛，血虛則痛”，初有心痛之描述，至東漢時期，張仲景在《金匱要略》中正式提出胸痹概念：“陽微陰弦，即胸痹而痛”。其病機(jī)主要為本虛標(biāo)實，虛實夾雜，標(biāo)實以血瘀、痰濕、氣滯、寒凝為主，本虛主要是氣虛、陰虛。據(jù)此，中醫(yī)針對冠心病的治則主要有活血化瘀法、宣痹通陽法、芳香溫通法、調(diào)整脾胃法、益氣養(yǎng)陰法、補(bǔ)腎固本法等。

中醫(yī)理論認(rèn)為“氣”是組成人體和維持人體基本生命活動的本元，有學(xué)者對中醫(yī)“氣”和西醫(yī)“線粒體”在來源、形態(tài)、功能、臨床表現(xiàn)、預(yù)防治療等方面的相關(guān)性進(jìn)行了研究，認(rèn)為中醫(yī)“氣”與西醫(yī)“線粒體”的作用非常相似。線粒體可產(chǎn)生能量證實氣化功能的體現(xiàn)，線粒體自噬的過程是清除受損的線粒體以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，這與中醫(yī)的益氣活血法相符合。線粒體自噬所發(fā)揮的作用即是中醫(yī)益氣活血法的微觀體現(xiàn)。故推測，中醫(yī)藥治療缺血性心臟病的主要作用靶點與線粒體密切相關(guān)[10，11]。

3 中藥參與調(diào)節(jié)線粒體自噬保護(hù)心肌缺血的相關(guān)機(jī)制

線粒體自噬的程度對心肌細(xì)胞保護(hù)起到雙向作用。具體表現(xiàn)為，正常情況下，心肌細(xì)胞自噬維持在一定的水平，這種基礎(chǔ)水平自噬是一種分解代謝平衡途徑，對減少心肌細(xì)胞死亡，維持心臟功能具有重要作用。而在心肌缺血階段，自噬降解非功能性胞質(zhì)蛋白，為關(guān)鍵生命活動提供關(guān)鍵營養(yǎng)，從而抑制細(xì)胞凋亡和壞死。因此，心肌缺血時自噬水平提高，可分解受損細(xì)胞器或異常蛋白質(zhì)為心肌代謝提供能量，維持心肌收縮力。若自噬下調(diào)，大量有害物質(zhì)則會在細(xì)胞內(nèi)積聚，導(dǎo)致細(xì)胞受損及死亡，加重疾病的發(fā)展。

隨著現(xiàn)代生物學(xué)研究的深入，越來越多的中藥及復(fù)方被證實可以通過調(diào)控不同的信號通路來調(diào)節(jié)線粒體自噬從而改善缺血/再灌注后的心肌細(xì)胞損傷。

3.1 調(diào)控PINK1/Parkin 通路

PINK1/Parkin 信號通路是線粒體自噬中最常見的通路，也是研究最清楚的一條通路，研究發(fā)現(xiàn)，很多中藥及復(fù)方可以通過調(diào)控該通路來調(diào)節(jié)線粒體自噬，最終改善心肌細(xì)胞損傷。

劉超等研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可通過激活PINK1/Parkin 信號通路促進(jìn)線粒體自噬，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞損傷，改善大鼠心臟功能和心室重構(gòu)情況[12]。李旭陽等研究了黃芪甲苷對缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞及線粒體自噬的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，結(jié)果顯示黃芪甲苷可通過降低PINK1、Parkin、p62、L3Ⅱ的表達(dá)，調(diào)控PINK1/Parkin 通路[13]。有實驗研究顯示，梓醇干預(yù)可上調(diào)缺氧缺糖H9c2心肌細(xì)胞Beclin1、LC3 和Parkin 表達(dá)，下調(diào)P62、PINK1 表達(dá)，并出現(xiàn)明顯的自噬小體，小體中包裹著破損的線粒體[14]。提示梓醇可通過上調(diào)PINK1/Parkin 通路，激活線粒體自噬來減輕心肌缺血損傷。丹參酮ⅡA 是丹參的主要活性成分之一，王佳楠等通過研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 能降低心肌缺血大鼠心肌線粒體中Beclin1 的表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，能促進(jìn)P62 蛋白的表達(dá)，同時大鼠心肌損傷情況得到明顯改善，推測丹參酮ⅡA 可通過抑制線粒體過度自噬來達(dá)到保護(hù)心肌的目的[15]。葒草苷對心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能與通過Parkin 依賴性和Parkin 非依賴性信號通路抑制心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬過度激活有關(guān)[16]。黃連素是中藥黃連的主要活性成分，臨床常用于治療痢疾桿菌和大腸桿菌引起的腸道感染，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)黃連素對缺血性心臟病也有獨特的調(diào)控作用。有研究顯示黃連素預(yù)處理可上調(diào)缺氧4h、復(fù)氧3h H9c2 心肌細(xì)胞PINK1、Parkin 蛋白含量，激活PINK1/Parkin 通路，促進(jìn)線粒體自噬，減輕MIRI[17]。五味子總木脂素是五味子的活性成分之一，有研究顯示五味子總木脂素可使衰老模型小鼠腦組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低。體外實驗也表明五味子總木脂素干預(yù)后小鼠大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元中LC3 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)減少，其作用機(jī)制與五味子總木脂素調(diào)節(jié)自噬作用有關(guān)[18]。

栝樓薤白半夏湯出自漢代張仲景所著的《金匱要略》，由栝蔞實、薤白、半夏等組成，具有行氣解郁，通陽散結(jié)，祛痰寬胸的功效，現(xiàn)代臨床常用于治療冠心病心絞痛等疾病的治療。動物實驗研究顯示，栝樓薤白半夏湯能顯著降低MIRI 大鼠血清CK-MB、LDH 含量，下調(diào)大鼠心肌Beclin-1、P62、PINK1、Parkin 蛋白表達(dá)，上調(diào)Mfn2 蛋白表達(dá)，提示栝樓薤白半夏湯可通過抑制Pink1/Parkin 信號通路，減輕線粒體自噬而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[19]。

通心絡(luò)是根據(jù)絡(luò)病理論所創(chuàng)立的復(fù)方中藥，由人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香（制）、酸棗仁（炒）、冰片組成。該方具有益氣活血、通絡(luò)止痛的功效，臨床主要用于冠心病心絞痛屬心氣虛乏、血瘀絡(luò)阻證的治療。實驗研究顯示，通心絡(luò)緩解心肌缺血再灌注損傷和調(diào)控心肌細(xì)胞自噬水平密切相關(guān)，通心絡(luò)可通過PINK1/Parkin 線粒體自噬通路清除損傷線粒體，并和泛素蛋白酶系統(tǒng)協(xié)同處理錯誤折疊蛋白的降解，維持細(xì)胞內(nèi)平衡，保護(hù)心肌細(xì)胞[20]。

益氣活血方為臨床經(jīng)驗用方，由生黃芪、人參、當(dāng)歸、川芎、三七組成。陳曦通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后，自噬蛋白與基因表達(dá)于7 天時增加，28 天時減少，運用益氣活血方可以于7 天、28 天動態(tài)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬蛋白與基因表達(dá)，于7 天時抑制LC3A、LC3B、Beclin1 蛋白表達(dá)，于28 天時促進(jìn)LC3A、LC3B、Beclin1 蛋白表達(dá)[21]。

加味丹參飲以補(bǔ)氣活血為法，由丹參、黃芪、赤芍、檀香、紅花、當(dāng)歸、川芎等藥組成。實驗證實，加味丹參飲能上調(diào)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及Beclin-1 的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞自噬，保護(hù)損傷的心肌細(xì)胞[22]。

痰瘀同治方由瓜蔞、薤白、清半夏、柴胡、赤芍、川芎、黃連、甘草等組成。動物實驗表明，痰瘀同治方能抑制心肌缺血再灌注模型大鼠缺血期Beclin-1 mRNA 的表達(dá)以及再灌注期Beclin-1、LC3 mRNA 的表達(dá)，表明痰瘀同治方可通過促進(jìn)缺血期自噬發(fā)生及抑制再灌注期自噬的過表達(dá)而發(fā)揮對心肌缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用[23]。

3.2 調(diào)控BNIP3/NIX 通路

丹酚酸B 是丹參中的一種酚類化合物，辛高杰采用H9c2 細(xì)胞探討丹酚酸B 保護(hù)缺氧/復(fù)氧損傷的機(jī)制是否與調(diào)控NIX 介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)，實驗結(jié)果顯示，丹酚酸B 能降低自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下調(diào)NIX 蛋白的表達(dá)，提示丹酚酸B 對H9c2 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用與抑制線粒體自噬發(fā)生有關(guān)，其具體機(jī)制可能為抑制NIX 介導(dǎo)的線粒體自噬激活，從而升高線粒體膜電位[24]。

有研究者采用H9c2 細(xì)胞缺氧4h 復(fù)氧3h 以及大鼠缺血30min、再灌注120min 兩種模型探討黃連素對MIRI 的作用，結(jié)果體內(nèi)外實驗均表明，黃連素預(yù)處理會增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、BNIP3和NIX 含量，可通過激活BNIP3/NIX 通路介導(dǎo)的線粒體自噬減輕心肌細(xì)胞及模型大鼠的缺血/再灌注損傷[25]。但也有研究顯示[26，27]黃連素預(yù)處理可通過降低ROS 水平以及抑制BNIP3/NIX 信號通路抑制過度自噬，提示黃連素對線粒體自噬具有雙重調(diào)控作用。

3.3 調(diào)控FUNDC1 通路

雙參寧心膠囊的主要成分為人參總皂苷，丹參總酚酸，元胡總生物堿[28]。該藥具有益氣行血，化瘀止痛之功效，臨床用以治理氣虛血瘀證的“胸痹”、“心痛”。實驗研究證實，雙參寧心膠囊對大鼠心肌缺血后再灌注階段心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬存在抑制作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該抑制作用可能與抑制FUNDC1 介導(dǎo)的線粒體自噬激活有關(guān)，而對BNIP3、NIX 介導(dǎo)的線粒體自噬未發(fā)現(xiàn)調(diào)控作用[29]。

3.4 調(diào)控AMPK-mTOR 通路

五味子具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素可顯著降低MIRI 模型小鼠心肌損傷指標(biāo)，其機(jī)制可能與升高線粒體自噬標(biāo)記蛋白環(huán)氧化酶Ⅰ的mRNA 水平、促進(jìn) Beclin1 蛋白表達(dá)水平以及激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1 信號通路有關(guān)[30]。

血府逐瘀湯是著名活血化瘀方劑，臨床用于治療多種心血管疾病。細(xì)胞實驗證實血府逐瘀湯對缺氧/復(fù)氧H9c2 細(xì)胞具有保護(hù)作用，機(jī)制研究結(jié)果顯示血府逐瘀湯可降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、下調(diào)Beclin-1 蛋白表達(dá)、抑制AMPK 活化、上調(diào)mTOR 磷酸化作用，提示血府逐瘀湯可通過調(diào)控AMPK-mTOR 信號通路抑制自噬保護(hù)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞[31]。

體外缺氧/復(fù)氧細(xì)胞實驗證實痰瘀同治方可通過調(diào)控AMPK-mTOR 通路、抑制自噬而起到心肌保護(hù)作用[32]。

3.5 調(diào)控PI3K-Akt-mTOR 通路

人參皂苷是一類固醇類化合物，主要存在于人參屬藥材中，也是人參的主要活性成分。實驗研究顯示，人參皂苷Rg1 能降低缺血再灌注模型大鼠LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1 表達(dá)水平，升高P62 表達(dá)水平，通過激活PI3K-Akt-mTOR 信號通路抑制過度的線粒體自噬，保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧損傷及體內(nèi)大鼠心肌缺血/再灌注損傷[33]。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，線粒體自噬與心肌缺血再灌注損傷關(guān)系密切，主要體現(xiàn)在兩個方面，一方面，早期適度的自噬可以清除受損線粒體從而保護(hù)心肌細(xì)胞；另一方面，晚期過度自噬會吞噬正常線粒體進(jìn)一步損傷心肌。

中藥具有多成分、多靶點的特點，可同時對多條信號通路產(chǎn)生影響，實驗研究也證實，很多中藥、復(fù)方或提取物對線粒體自噬具有雙重調(diào)控作用，當(dāng)自噬不足時可激活線粒體自噬途徑，當(dāng)自噬過度時，可抑制線粒體過度自噬。其機(jī)制主要與調(diào)控PINK1/Parkin 通路、BNIP3/NIX 通路、FUNDC1 通路、AMPK-mTOR 通路、PI3K-Akt-mTOR 通路等信號通路有關(guān)。但目前的研究對藥物和化合物種類覆蓋還不夠全面，單味藥提取物的研究主要局限于黃酮類、皂苷類以及酚類成分，對其它成分的研究較少；中藥復(fù)方的研究主要局限于具有補(bǔ)氣、活血、化瘀、行氣、通絡(luò)功效的復(fù)方。今后應(yīng)在中醫(yī)藥理論之下，加強(qiáng)中藥及復(fù)方的基礎(chǔ)實驗研究，進(jìn)一步闡明中醫(yī)藥對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為臨床心肌缺血再灌注損傷的治療提供更多的參考價值。