外泌體與喉癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展

王正，衛(wèi)旭東

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院 耳鼻咽喉-頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

0 引言

喉癌是頭頸部腫瘤中常見(jiàn)的腫瘤之一，對(duì)喉癌的治療有手術(shù)和放化療、生物治療等，但其較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是一大難題。迫切需要尋找其他新型有效的治療方法，近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞理論的提出及外泌體的發(fā)現(xiàn)給我們帶來(lái)了新的啟發(fā),可提供新的思路開(kāi)發(fā)新的喉癌治療方法。

1 腫瘤干細(xì)胞

1.1 腫瘤干細(xì)胞概念、來(lái)源與生理

腫瘤干細(xì)胞是一種能夠產(chǎn)生異質(zhì)腫瘤細(xì)胞的自我更新細(xì)胞[1]。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)上，腫瘤是由體細(xì)胞突變而成，每個(gè)腫瘤細(xì)胞都可以無(wú)限制地生長(zhǎng)，但這并不能完全解釋其無(wú)限增殖的能力。有研究表明，腫瘤細(xì)胞中只有一小部分細(xì)胞才能在移植后成為腫瘤[2]，這跟干細(xì)胞的特性相似。因此，有學(xué)者[3]提出腫瘤干細(xì)胞理論(tumor stem cell,TSC),該理論認(rèn)為腫瘤細(xì)胞中存在著極少量具有無(wú)限增殖能力、可自我更新及多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞，對(duì)于腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了理論依據(jù)。這一理論也讓我們重新認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生和發(fā)展，以及對(duì)于臨床治療腫瘤提供了新的研究方向和方法。

對(duì)于腫瘤干細(xì)胞有多種學(xué)說(shuō)來(lái)解釋來(lái)源，但比較認(rèn)可的有兩大觀點(diǎn)。其中有一個(gè)學(xué)說(shuō)認(rèn)為, 腫瘤干細(xì)胞的起源是由于各種因素的作用下正常干細(xì)胞發(fā)生的基因突變等等原因所轉(zhuǎn)變而來(lái)。因此腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞的特性特別相似,由同樣的信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞自我更新、增殖和分化等等[4]。在一些腫瘤中，一些學(xué)者們通過(guò)研究也證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞來(lái)源于正常干細(xì)胞的突變[5]。但還有一種學(xué)說(shuō)認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞來(lái)源于祖細(xì)胞，祖細(xì)胞是一種來(lái)源于干細(xì)胞的早期分化類(lèi)型, 相較于干細(xì)胞它有更為定向的細(xì)胞特征, 比如較低的自我更新能力以及有限的復(fù)制性[6]。關(guān)于祖細(xì)胞的特性, 很多研究顯示它可以分化成為腫瘤干細(xì)胞。一個(gè)正常的祖細(xì)胞,經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后可以分化成多種家系的腫瘤干細(xì)胞[7]。雖然有多種觀點(diǎn)來(lái)解釋腫瘤干細(xì)胞的來(lái)源，但不管是從體細(xì)胞還是祖細(xì)胞來(lái)源，兩者都有其共同點(diǎn)，都支持腫瘤干細(xì)胞可以自我更新及無(wú)限增殖。

腫瘤干細(xì)胞跟正常干細(xì)胞一樣都具有自我更新和多向分化的能力[8]。腫瘤干細(xì)胞對(duì)腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等都有著很重要的作用。腫瘤干細(xì)胞通過(guò)自我更新和無(wú)限增殖維持著腫瘤細(xì)胞群的生命力，腫瘤干細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷徙能力又使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移成為可能[9]。有研究表明腫瘤干細(xì)胞同時(shí)也會(huì)對(duì)放療或化療產(chǎn)生耐藥性，例如，其可以增強(qiáng)對(duì)DNA損傷識(shí)別和修復(fù)的能力, 從而使其存活，產(chǎn)生化療抗性[10]。有研究表明腫瘤干細(xì)胞可以通過(guò)不同機(jī)制耐藥[11]。常規(guī)的腫瘤治療方法，如化療只能消滅一小部分腫瘤細(xì)胞，然而對(duì)腫瘤干細(xì)胞的殺傷不足，腫瘤往往在治療一段時(shí)間后復(fù)發(fā)。因此大部分腫瘤的治療失敗的原因可歸咎于腫瘤干細(xì)胞的存在。因此未來(lái)治療腫瘤的新方向是找到腫瘤干細(xì)胞特異性治療靶點(diǎn)。

1.2 喉癌腫瘤干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀

腫瘤干細(xì)胞最早在白血病的研究中發(fā)現(xiàn)[12]，而后在許多惡性腫瘤中都相繼發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的存在，如在喉癌細(xì)胞中證實(shí)了喉癌干細(xì)胞的存在[13]。喉癌腫瘤細(xì)胞中的喉癌干細(xì)胞數(shù)量很少，但其卻是喉癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移甚至耐藥的主要原因，對(duì)于喉癌干細(xì)胞主要的研究方向是對(duì)其表面標(biāo)志物或通過(guò)其相關(guān)信號(hào)通路來(lái)達(dá)到抑制喉癌干細(xì)胞的目的。因此對(duì)喉癌干細(xì)胞的研究有助于治療或預(yù)防喉癌。有研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)研究以Hep-2 喉癌細(xì)胞系及喉鱗狀細(xì)胞癌實(shí)體瘤為研究對(duì)象，研究喉癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性及自我更新機(jī)制。研究并首次證實(shí)了喉癌組織細(xì)胞中，CD133+Hep-2 細(xì)胞具有強(qiáng)的增殖、侵襲能力及克隆形成能力，對(duì)放化療有抵抗性，具有干細(xì)胞特性[14]；CD133+腫瘤干細(xì)胞中，抗凋亡基因表達(dá)上調(diào)，是CD133+Hep-2 細(xì)胞自我更新的物質(zhì)基礎(chǔ)，干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路Wnt、Hedgehog 以及Bmi-l 信號(hào)通路處于活化狀態(tài)，靶向這些信號(hào)通路，有望有效殺傷喉癌干細(xì)胞,在喉癌實(shí)體瘤干細(xì)胞中，Bmi-1 通過(guò)抑制下游INK4a/ARF 基因轉(zhuǎn)錄及P16ink4a/P14ARF 蛋白表達(dá)調(diào)控喉癌實(shí)體瘤干細(xì)胞自我更新，Bmi-1 基因有望是喉癌干細(xì)胞靶向治療新的位點(diǎn)[14]。

研究中發(fā)現(xiàn)喉癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物有CD133[13]、CD44[15]、ALDH-1[16,17]等。有研究表明這些標(biāo)志物對(duì)腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤免疫逃逸、藥物耐受和放療抵抗均有相關(guān)性[18]，這些標(biāo)志物有可能成為新的喉癌干細(xì)胞治療靶點(diǎn)。有研究表明RNA 干擾TRAP1 表達(dá)抑制CD133～+CD44～+喉癌干細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡[19]等。

喉癌干細(xì)胞的形成及轉(zhuǎn)化是多種信號(hào)通路共同作用的結(jié)果。喉癌自我更新相關(guān)的Hedgehog 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路及Bmi-l 通路[14]。因此尋找有效的信號(hào)通路，并通過(guò)其抑制喉癌干細(xì)胞是一大研究熱點(diǎn)。例如，RGD 肽可以通過(guò)抑制VEGF 介導(dǎo)的STAT3/HIF-1α 通路而抑制喉癌干細(xì)胞[20]。或者通過(guò)某一信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)藥物發(fā)揮的功效，例如順鉑在很多腫瘤包括喉癌都有作用，而有研究發(fā)現(xiàn)IL-6 的核糖核酸干擾抑制通過(guò)下調(diào)IL-6/STAT3/HIF1 通路增強(qiáng)順鉑在喉癌干細(xì)胞中的功效[21]。

在喉癌干細(xì)胞的研究中，不論通過(guò)發(fā)現(xiàn)喉癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，進(jìn)而識(shí)別標(biāo)志物再達(dá)到精準(zhǔn)的靶向治療，還是通過(guò)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)直接抑制喉癌干細(xì)胞或增強(qiáng)藥物的功效都是我們?nèi)〉玫囊恍┏晒?/p>

2 外泌體

2.1 外泌體概念

外泌體是起源于核內(nèi)體、大小為 30 ～ 100nm 的細(xì)胞外囊泡,最早在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)了外泌體[22]，不過(guò)當(dāng)時(shí)人們認(rèn)為外泌體的作用只是將代謝垃圾從細(xì)胞內(nèi)運(yùn)出細(xì)胞外而未給予足夠的重視。直到1996 年,Raposo等人發(fā)現(xiàn)外泌體具有呈遞抗原,并刺激T 細(xì)胞增殖的作用[23],而受到關(guān)注并開(kāi)始研究。

外泌體內(nèi)包含有許多的生物活性物質(zhì)，如蛋白、核酸及脂類(lèi)等[24]。除了某些特殊的細(xì)胞外幾乎所有細(xì)胞都釋放外泌體，,包括血液、唾液、尿液、腦脊液等[25]體液中廣泛存在。外泌體作為細(xì)胞間物質(zhì)交換的載體，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間通訊，參與機(jī)體各種生理及病理過(guò)程[24]，對(duì)生物有重要的生理意義。

2.2 外泌體的提取及生物特性

外泌體可攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA，參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程[26]。而來(lái)源于不同細(xì)胞的外泌體其對(duì)受體的作用也大有不同，在機(jī)體內(nèi)可發(fā)揮不同的作用。例如，研究表明外泌體不僅在正常細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用也會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響[27]。有研究表明外泌體與靶細(xì)胞的識(shí)別具有特異性，如血小板來(lái)源的外泌體能識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，不能識(shí)別中性粒細(xì)胞[26]；而中性粒細(xì)胞來(lái)源的外泌體則可識(shí)別血小板、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞等[26]，而這對(duì)利用外泌體來(lái)研制靶向藥物提供了可能性。對(duì)外泌體的提取中仍沒(méi)有一種方法能同時(shí)保證外泌體的含量、純度、生物活性等[26]。如何開(kāi)發(fā)高效、快速、穩(wěn)定, 并且能完整保留其結(jié)構(gòu)和生物功能的方法, 是目前外泌體能應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)及前提,目前常用的提取方法一般有離心法、超濾法、免疫法、沉淀法等[28]。

2.3 外泌體與喉癌腫瘤干細(xì)胞

2.3.1 外泌體與腫瘤干細(xì)胞

外泌體在腫瘤診斷和治療上也有很大的作用。而且同細(xì)胞分泌的外泌體的功能不盡相同，使用不同細(xì)胞來(lái)源外泌體診斷或治療疾病及腫瘤被廣泛研究，如，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體增強(qiáng)牙周韌帶細(xì)胞功能促進(jìn)牙周再生[29]。尿外泌體在腎臟疾病中的研究[30]、外泌體在心血管疾病方面的研究[31]等。利用不同來(lái)源外泌體診斷治療腫瘤是最近的研究熱點(diǎn)。除了利用外泌體本身之外，有研究表明，依靠外泌體的特性, 可將外泌體作為一種載帶核酸、化學(xué)、蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的載體[32]。相關(guān)的研究中已經(jīng)表明此種方法的可行性。近年來(lái), 在腫瘤靶向治療中，由于外泌體來(lái)源廣泛、納米尺寸和良好的生物相容性，許多研究人員成功地從不同細(xì)胞中構(gòu)建了作為治療性載體的一種靶向治療方式[33]。不論使用外泌體本身的特性還是改造外泌體作為載體治療疾病都是未來(lái)的研究方向。

腫瘤細(xì)胞自身也可分泌外泌體，并進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮雙向調(diào)控作用，不僅促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，同時(shí)對(duì)其發(fā)生及發(fā)展也可產(chǎn)生抑制作用。其外泌體及其分泌的各種生物學(xué)物質(zhì)，均可在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要的生理作用。例如，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、惡化和免疫逃逸過(guò)程中起到很重要的作用[34]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[35,36]。一項(xiàng)研究報(bào)道中，給予預(yù)先種植卵巢癌細(xì)胞的小鼠的腹腔內(nèi)注射從卵巢癌患者腹腔積液中分離出的外泌體，可以明顯促進(jìn)小鼠腹腔內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[35]。而腫瘤分泌的外泌體促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)是通過(guò)不同的途徑來(lái)進(jìn)行的，如乳腺癌外泌體通過(guò)抑制NK 細(xì)胞功能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[36]等。外泌體不僅對(duì)腫瘤有促進(jìn)作用，也有抑制作用。有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以抑制腫瘤的增殖，例如來(lái)自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體含有促進(jìn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞休眠的microRNA[37]。

腫瘤外泌體能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，在腫瘤的轉(zhuǎn)移中通過(guò)不同的途徑發(fā)揮著其獨(dú)特的作用。腫瘤外泌體內(nèi)含的多種物質(zhì)對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移有一定的影響。有研究表明來(lái)自高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的外泌體miRNA 可誘導(dǎo)低轉(zhuǎn)移細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[38]。同時(shí)腫瘤干細(xì)胞外泌體可以通過(guò)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為來(lái)促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[39]。近來(lái)研究中發(fā)現(xiàn)外泌體在腫瘤的上皮間質(zhì)化過(guò)程中可以起到一定作用[40]，而上皮間質(zhì)化在腫瘤的轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用?？傊?，不同來(lái)源外泌體包括腫瘤來(lái)源外泌體在各種不同腫瘤中的作用有待進(jìn)一步的深入研究。

2.3.2 外泌體與喉癌腫瘤干細(xì)胞

外泌體與腫瘤干細(xì)胞包括喉癌干細(xì)胞，既有促進(jìn)也有抑制的作用。同時(shí)腫瘤干細(xì)胞自身也會(huì)分泌外泌體，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)控作用如高表達(dá)ANXA2 的肝癌干細(xì)胞的外泌體對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特性具有調(diào)控作用[41]。同時(shí)其對(duì)腫瘤干細(xì)胞自身或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生雙向的調(diào)控作用。例如，有研究表明腫瘤樣干細(xì)胞Piwil2-iCSC 外泌體能促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[39]。而在抑制性作用方面，喉癌Hep-2 細(xì)胞來(lái)源外泌體能成為樹(shù)突細(xì)胞（DC）并刺激T細(xì)胞增殖而抑制喉癌細(xì)胞生長(zhǎng)[42]等。喉癌細(xì)胞或喉癌干細(xì)胞來(lái)源外泌體其內(nèi)部富含豐富的信息物質(zhì)包括癌細(xì)胞信息，如mRNA、miRNA 等，這讓其成為新的喉癌腫瘤標(biāo)記物成為可能，當(dāng)其被分泌到體液中時(shí)可通過(guò)對(duì)其檢測(cè)得到一定的腫瘤信息。例如Joseph 等[43]研究使用表面增強(qiáng)拉曼光譜法對(duì)外泌體進(jìn)行分析檢測(cè)胰腺癌。還有研究表明可通過(guò)直接評(píng)估外泌體的蛋白質(zhì)含量來(lái)區(qū)分具有不同上皮和間充質(zhì)表型的乳腺癌亞型[44]。也有研究表明對(duì)喉癌患者血清中外泌體miRNA-21 和HOTAIR 的檢測(cè)可以作為喉癌患者診斷的標(biāo)志物[45]。同時(shí)外泌體因其生物特性可以成為藥物載體，在靶向治療中發(fā)揮作用。例如，外泌體可以裝載siRNA,miRNA,相關(guān)蛋白以及小分子化合物等,具有抗腫瘤特性外泌體被傳遞到靶組織發(fā)揮治療作用[46]。有研究通過(guò)外泌體較高的血清穩(wěn)定性、毒性低、易通過(guò)各種屏障、較高的生物相容性和較低的免疫原性等特性治療乳腺癌[47,48]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)載藥腫瘤細(xì)胞外泌體對(duì)CD133+乳腺癌腫瘤干細(xì)胞具有一定的抑制作用[49]。而CD133+也是喉癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物質(zhì)之一，腫瘤細(xì)胞外泌體對(duì)喉癌腫瘤干細(xì)胞是否有抑制作用有待于進(jìn)一步的研究。綜上所述，對(duì)外泌體進(jìn)行一定的改造或可以成為喉癌治療的重要靶點(diǎn)和工具。

目前腫瘤干細(xì)胞和外泌體的研究已經(jīng)取得了一些成果，例如發(fā)現(xiàn)外泌體對(duì)腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控作用，或者通過(guò)對(duì)外泌體的檢測(cè)來(lái)達(dá)到對(duì)腫瘤的檢測(cè)，如檢測(cè)外泌體miRNA-21 和HOTAIR 的檢測(cè)以發(fā)現(xiàn)喉癌[45]等。來(lái)源不同的外泌體的功能也不盡相同，因此許多研究者致力于研究來(lái)源不同的外泌體的功能及其在可以腫瘤中發(fā)揮的作用。例如由腫瘤干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)自身腫瘤的調(diào)控作用和外泌體跟腫瘤干細(xì)胞之間相互平衡的關(guān)系同樣也是研究的熱點(diǎn)。對(duì)于外泌體和腫瘤干細(xì)胞之間更深入相關(guān)性有待于進(jìn)一步的研究。

3 總結(jié)

近年來(lái)，對(duì)腫瘤干細(xì)胞和外泌體的研究日益增多，對(duì)于外泌體的生物學(xué)作用及其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用的研究取得了一定的進(jìn)展。幾乎所有細(xì)胞包括腫瘤干細(xì)胞都會(huì)分泌外泌體，對(duì)外泌體的檢測(cè)或可以成為新的腫瘤標(biāo)志物檢查方法，對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療有重要意義。而外泌體不僅對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有促進(jìn)作用也有其抑制的作用。外泌體可以對(duì)腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和診療思路，而腫瘤干細(xì)胞對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的意義，研究腫瘤干細(xì)胞和外泌體的相互作用，利用外泌體本身或其他方法去治療腫瘤是研究的熱點(diǎn)之一。目前外泌體已經(jīng)在多種疾病的檢測(cè)及治療中都發(fā)揮了重要作用。雖然外泌體很有研究?jī)r(jià)值，但對(duì)于任何一種新的事物我們都應(yīng)該更加的慎重，嚴(yán)格對(duì)其驗(yàn)證和測(cè)試，應(yīng)對(duì)外泌體進(jìn)行更多更深入的研究。