解凍方式對(duì)冷凍泥鰍肌肉組織理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的影響

鄭 捷，徐婷婷，胡愛(ài)軍，*，高建忠

(1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 天津 300457；2.天津鴻騰水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司， 天津 301800)

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)屬鯉形目，體形細(xì)長(zhǎng)，在我國(guó)許多區(qū)域均有分布。泥鰍的營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸以及鈉、鉀等多種微量元素。泥鰍魚肉脂肪和膽固醇含量低，肌肉中的必需氨基酸含量占總氨基酸的比例較高，其不飽和脂肪酸占總脂肪酸的含量超過(guò)了60%。泥鰍生活水溫10～30 ℃，冬季水溫下降到5 ℃以下時(shí)，會(huì)鉆入泥中20～30 cm深處越冬。泥鰍在冬季不易捕撈，產(chǎn)量較少，而春秋兩季氣候適宜，適合泥鰍生長(zhǎng)，產(chǎn)量較多，這使得泥鰍的產(chǎn)業(yè)化加工受到季節(jié)限制。

大多數(shù)魚類產(chǎn)品多為冷凍運(yùn)輸，冷凍雖能延長(zhǎng)貨架期，但是水產(chǎn)品在凍藏中會(huì)發(fā)生損傷及蛋白質(zhì)的冷凍變性[1]。魚肉在解凍過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失、蛋白質(zhì)析出、脂肪氧化等問(wèn)題，選擇合適的解凍方式能夠有效降低其對(duì)魚肉品質(zhì)的不利影響。目前，常見(jiàn)的解凍方式有流水解凍、空氣解凍、電場(chǎng)解凍等。關(guān)于冷凍和解凍對(duì)肌肉組織的物理和化學(xué)性質(zhì)的影響研究大多數(shù)集中在深海魚和畜肉(豬牛羊等)，對(duì)淡水魚類的研究較少，解凍方式對(duì)泥鰍肌肉組織理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)比較了4 ℃解凍、室溫解凍、流水解凍、微波解凍、超聲解凍5種不同解凍方式對(duì)冷凍泥鰍品質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響，并結(jié)合低場(chǎng)核磁共振技術(shù)(LF-NMR)，研究解凍對(duì)泥鰍魚肉水分分布的影響，最終確定一種較佳解凍方式，希望為泥鰍的解凍及加工提供理論和技術(shù)支持，并為相關(guān)水產(chǎn)品的解凍和加工技術(shù)提升提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泥鰍為天津市寶坻區(qū)鮮活黃坂泥鰍，質(zhì)量為(42.0±2.7)g；碘化鉀，天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀，天津恒興化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；牛血清蛋白，天津凱思博生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha- 1502型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司；PHS- 3BW型pH計(jì)，上海邦特儀器有限公司；G80F23CN3L- C2(B6)型微波爐，廣東美的電器制造公司；TDZ5- WS型離心機(jī)，Thermo Fisher公司；FA2204B型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；AS- D型溫度計(jì)，保德儀器具公司；SU1510型掃描電子顯微鏡，德國(guó)里奧公司；MicroMR型低場(chǎng)核磁共振儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；HH- 4J型水浴鍋，金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 凍結(jié)方式及前處理方法

將鮮活泥鰍宰殺后去除內(nèi)臟，清洗干凈用自封袋包裝后放入-18 ℃的冰箱內(nèi)凍結(jié)。凍結(jié)48 h后取出，解凍方式見(jiàn)表1，然后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

表1 泥鰍解凍方式Tab.1 Thawing methods of loach

1.4 理化指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1解凍時(shí)間的確定

將溫度探頭放入魚體中心，直至魚肉中心溫度達(dá)到2 ℃，記錄解凍時(shí)間。

1.4.2解凍損失率的測(cè)定

精確測(cè)量泥鰍解凍前后的質(zhì)量，按照式(1)計(jì)算解凍損失率。

(1)

式(1)中：m1為凍結(jié)前泥鰍的質(zhì)量，g；m2為解凍后泥鰍的質(zhì)量，g。

1.4.3蒸煮損失率的測(cè)定

稱量5 g的泥鰍樣品，放入50 mL的離心管中，放入沸水浴中蒸煮10 min，冷卻后吸干表面水分，按式(2)計(jì)算蒸煮損失率。

(2)

式(2)中：m1為蒸煮前樣品的質(zhì)量，g；m2為蒸煮后泥鰍的質(zhì)量，g。

1.4.4泥鰍魚肉pH值的測(cè)定

稱取解凍后的泥鰍背部肌肉10 g，剪碎后加入90 mL蒸餾水，高速勻漿1 min，4 ℃浸泡20 min，過(guò)濾后用pH計(jì)測(cè)定濾液的pH值。

1.4.5解凍后泥鰍魚肉蛋白質(zhì)溶解性的測(cè)定

參照J(rèn)oo[2]的方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，測(cè)定蛋白質(zhì)的溶解性。

1) 肌漿蛋白質(zhì)的測(cè)定。取泥鰍魚脊背部肌肉1 g，加入10 mL pH值為7.2的磷酸緩沖液(提前配置放入4 ℃冰箱1 h后使用)，3 000 r/min勻漿1 min，4 ℃抽提6 h，在離心速度為4 000 r/min，溫度為4 ℃的條件下離心20 min。上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。

2) 總可溶解蛋白質(zhì)的測(cè)定。取泥鰍魚脊背部肌肉1 g，加入20 mL 4 ℃KI(1.1 mol/L)，3 000 r/min勻漿1 min，4 ℃抽提6 h，在離心速度為4 000 r/min，溫度為4 ℃的條件下離心20 min。上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。

3) 肌纖維蛋白質(zhì)的測(cè)定。肌纖維蛋白質(zhì)=總可溶解蛋白質(zhì)- 肌漿蛋白質(zhì)。

1.4.6解凍后泥鰍魚肉質(zhì)構(gòu)特性分析

泥鰍解凍后的黏聚性、彈性、咀嚼度及硬度采用質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)定。TPA的設(shè)置參數(shù)：測(cè)定部位(泥鰍脊背部組織)；樣品壓縮形變量30%，測(cè)前速度2.0 mm/s，測(cè)中速度1.0 mm/s，測(cè)后速度1.0 mm/s，觸發(fā)力5 g；選用平底柱形探頭P/36R。

1.4.7解凍后泥鰍魚肉微觀結(jié)構(gòu)分析

取解凍后泥鰍背部肌肉，剪切成大小為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的組織，放在體積分?jǐn)?shù)為4%的戊二醛溶液中固定12 h。用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、90%的乙醇及無(wú)水乙醇依次洗脫，進(jìn)行凍干[3]。噴金后用掃描電鏡(SEM)觀察泥鰍魚肉縱切面的微觀結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)為200倍。

1.4.8解凍后泥鰍魚肉水分分布分析

將泥鰍魚肉樣品放入與纖維方向垂直的圓柱形核磁管(直徑14 mm，高20 cm)中，置于直徑為18 mm的NMR 探頭上，使用標(biāo)準(zhǔn)油樣和FID序列進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)參數(shù)：NS(重復(fù)掃描次數(shù))=2，TW(重復(fù)掃描等待時(shí)間)=1 000 ms。用CPMG(Carr，Purcell，Meiboom，Gill)脈沖序列測(cè)量肉樣的橫向弛豫時(shí)間(T2)，CPMG實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為：NECH(回波個(gè)數(shù))=4 000，TW=3 000 ms，TE(回波時(shí)間)=0.6 ms，NS=8。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20軟件，采用Origin 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 解凍方式對(duì)冷凍泥鰍品質(zhì)的影響

不同解凍方式對(duì)冷凍泥鰍品質(zhì)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。不同解凍方式對(duì)泥鰍解凍損失率的影響存在顯著差異(P<0.05)，其中，微波解凍的損失率最大，流水解凍的損失率最小。魚肉在冷凍過(guò)程中形成冰晶，肌肉組織受到擠壓，造成細(xì)胞失水。在解凍過(guò)程中，冰晶融化，部分水滲透回細(xì)胞，剩余部分流失，造成解凍損失。郭恒等[4]在研究解凍溫度對(duì)冷凍鮐魚品質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，與空氣解凍、4 ℃解凍、靜水解凍相比，流水解凍的損失率最小。解凍速率越大，解凍損失率越大。微波解凍時(shí)間最短，速率最大，解凍損失率也最高；超聲解凍過(guò)程中，魚肉表面的溫度高于內(nèi)部中心溫度，降低了肌肉蛋白的持水力[5]，超聲解凍表現(xiàn)出較高的解凍損失率。

表2 不同解凍方式對(duì)冷凍泥鰍品質(zhì)的影響Tab.2 Effects of different thawing methods on quality of frozen loach

蒸煮損失率由大到小按解凍方式排列順序?yàn)椋何⒉ń鈨觥⑹覝亟鈨?、超聲解凍? ℃解凍、流水解凍、新鮮樣品。在解凍過(guò)程中，肌肉蛋白發(fā)生變性，使其維持水分的能力下降，造成汁液流失[6]。微波解凍的蒸煮損失率最高，這是由于微波解凍的環(huán)境溫度高，加劇了泥鰍蛋白質(zhì)的聚集及形變的程度[7]，持水力下降。Shore[8]研究超聲在食品凍結(jié)和解凍過(guò)程中速度和衰減特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，凍結(jié)后食品吸收超聲波的能力急劇增強(qiáng)，超聲波會(huì)使泥鰍的肌肉纖維間隙變大，持水能力下降，造成蒸煮損失率變大，這與魚肉的微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。

魚體死后中斷供氧，體內(nèi)的肌糖原由有氧分解轉(zhuǎn)化為無(wú)氧酵解，產(chǎn)生H+，同時(shí)，三磷酸腺苷為無(wú)氧酵解提供能量，產(chǎn)生磷酸等酸性物質(zhì)，這些酸性物質(zhì)導(dǎo)致了魚肉pH值下降[9]。解凍后泥鰍魚肉的pH值均下降，其中4 ℃解凍的下降最明顯。超聲解凍和流水解凍的pH值與新鮮泥鰍無(wú)顯著差異。4 ℃解凍的pH值最低，推測(cè)是解凍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞無(wú)氧酵解時(shí)間長(zhǎng)，酸性物質(zhì)積累多。此外，解凍過(guò)程中魚肉表面存在細(xì)菌，加速食品的酸敗。微波解凍的pH值較低可能與水分損失和解凍溫度過(guò)高有關(guān)。pH值可作為判斷魚類新鮮度的指標(biāo)之一，有研究表明，pH值變化會(huì)影響肉類的顏色以及持水力，并呈正相關(guān)[10]。

2.2 解凍方式對(duì)冷凍泥鰍蛋白質(zhì)溶解性的影響

解凍方式對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。肌肉蛋白的溶解性是指總肌肉蛋白可進(jìn)入溶液的蛋白量所占的比例，這些蛋白在一定的離心力作用下不發(fā)生沉淀。蛋白質(zhì)與水之間的作用力主要是蛋白質(zhì)中的肽鍵，或氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)同水分子之間發(fā)生的相互作用。魚肉在凍結(jié)- 解凍的過(guò)程會(huì)增加蛋白質(zhì)的去折疊和變性程度，導(dǎo)致蛋白質(zhì)可溶性降低[11]。解凍后肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和全蛋白的含量均有所下降，其中，微波解凍損失的可溶性蛋白最多，超聲解凍相對(duì)于其他解凍方式可溶性蛋白損失最小。Leygonie[12]研究發(fā)現(xiàn)，解凍溫度的升高會(huì)使蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)數(shù)目增加、三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致蛋白間的交聯(lián)，引起蛋白溶解性的降低。根據(jù) Przybylski[13]的報(bào)道，肌肉滲出物是肌漿蛋白的良好來(lái)源，因此，水溶性蛋白含量變化可用解凍損失來(lái)解釋，即高解凍損失對(duì)應(yīng)低可溶性蛋白含量。研究表明，一定程度的超聲處理可增加可溶性蛋白含量，提高蛋白溶解性[14]，這是由于超聲的空化作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，使疏水性多肽展開(kāi)朝向脂質(zhì)而極性部分朝向水相[15]。

表3 解凍方式對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響Tab.3 Effect of thawing methods on protein solubility mg/g

2.3 解凍方式對(duì)冷凍泥鰍魚肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

解凍方式對(duì)冷凍泥鰍魚肉質(zhì)構(gòu)特性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。質(zhì)構(gòu)是肉制品主要的感官指標(biāo)之一，直接關(guān)系到嫩度、口感、可食性和加工出品率[16]。不同解凍方式表現(xiàn)出的質(zhì)構(gòu)特性差異主要與肌肉中的蛋白質(zhì)在解凍過(guò)程中物化性質(zhì)和新鮮度有關(guān)[17]。解凍過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生自溶作用，逐漸分解成小分子物質(zhì)，肉的質(zhì)構(gòu)特性發(fā)生變化。黏聚性反映魚肉抵抗外界損傷而緊密連接使其保持完整性的能力。5種解凍方式的黏聚性較新鮮魚肉均有下降，其中，4 ℃解凍泥鰍魚肉的黏聚性最高，超聲解凍最低。解凍環(huán)境的溫度會(huì)影響?zhàn)ぞ坌缘拇笮。收嚓P(guān)，這是因?yàn)闇囟壬邥?huì)使細(xì)胞結(jié)合力不斷下降。超聲解凍黏聚性下降可能是因?yàn)槌曉趥鞑ミ^(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞結(jié)合力減小。彈性反映的是魚肉受到形變后恢復(fù)原樣的能力。流水解凍魚肉的彈性最好，微波和超聲彈性較低，這是由于微波和超聲的熱效應(yīng)致使肌動(dòng)球蛋白變性，彈性減小。微波處理溫度最高，解凍后的魚肉彈性最小。硬度和咀嚼度的變化趨勢(shì)一致，微波解凍的咀嚼度最高，這種變化主要與肌肉組織蛋白變性有關(guān)。

2.4 各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析

各指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表4。解凍損失率與蒸煮損失率呈顯著正相關(guān)，與肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和全蛋白的溶解度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與解凍pH值呈顯著負(fù)相關(guān)。蒸煮損失率與解凍pH值、肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和全蛋白的溶解度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與硬度呈極顯著正相關(guān)。解凍pH值與蛋白質(zhì)的溶解性呈極顯著正相關(guān)。肌漿蛋白溶解性與全蛋白呈極顯著正相關(guān)，與硬度呈極顯著負(fù)相關(guān)，肌原纖維蛋白與其他指標(biāo)的相關(guān)性與肌漿蛋白相似。全蛋白與硬度呈極顯著負(fù)相關(guān)。對(duì)此9項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析具有重要意義，有利于簡(jiǎn)化和篩選指標(biāo)，提高結(jié)果分析的準(zhǔn)確性[18]。本實(shí)驗(yàn)中，肌漿蛋白的溶解性與其他指標(biāo)均呈極顯著相關(guān)，因此，可選用該指標(biāo)來(lái)判斷解凍效果。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 解凍方式對(duì)泥鰍魚肉質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig.1 Effect of thawing methods on texture characteristics of loach

表4 指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.5 不同解凍方式泥鰍肌肉超微結(jié)構(gòu)分析

不同解凍方式泥鰍肌肉超微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。圖2結(jié)果表明，新鮮泥鰍肌肉纖維排列緊密，解凍后的肌肉纖維都出現(xiàn)了不同程度的肌肉空隙。Pisal[19]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)變性和內(nèi)膜破裂可導(dǎo)致肌纖維結(jié)構(gòu)的破壞。解凍方式不當(dāng)，肌原纖維容易發(fā)生結(jié)構(gòu)斷裂[20]，解凍過(guò)程可直接改變肌肉的微觀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致保水力發(fā)生變化。從微波解凍魚肉的SEM圖可以明顯看出肌肉纖維已出現(xiàn)斷裂、變性。超聲解凍的空隙最大，是因?yàn)槌暰哂袡C(jī)械效應(yīng)和空穴效應(yīng)，較大的超聲功率會(huì)產(chǎn)生空泡，使肌肉纖維發(fā)生變形。肌肉纖維的破損程度表明了蛋白質(zhì)的變性程度，微波解凍肌肉纖維的破損程度最高，蛋白質(zhì)變性程度也最高。肌肉纖維空隙變化規(guī)律與解凍損失率、蛋白質(zhì)溶解性變化規(guī)律一致。肌肉纖維間隙的變大還會(huì)引起魚肉中自由水含量的增多[21]，這與水分分布結(jié)果相一致。

圖2 不同解凍方式泥鰍魚肉的SEM圖Fig.2 SEM images of loach meat with different thawing methods

2.6 不同解凍方式泥鰍魚肉的水分分布分析

不同解凍方式泥鰍魚肉的T2分布見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，T2譜圖上出現(xiàn)3個(gè)峰，從左到右依次為結(jié)合水、不易流動(dòng)水、自由水。T20代表與大分子結(jié)合最緊密并且不受外界壓力影響的水分狀態(tài)，T21是存在于肌纖維及膜之間的水分狀態(tài)，T22是存在于細(xì)胞外間隙的水分狀態(tài)，主要是靠毛細(xì)管凝結(jié)作用而存在于肌肉中的自由水[22-24]。圖3表明，新鮮樣品和微波解凍有3個(gè)峰(T20、T21和T22)，其余解凍方式只有2個(gè)峰(T21和T22)，其中T21峰面積、信號(hào)強(qiáng)度最大，說(shuō)明泥鰍魚肉中水分主要以不易流動(dòng)水的形式存在。

圖3 不同解凍方式泥鰍魚肉的橫向弛豫時(shí)間分布Fig.3 Distribution of transverse relaxation time of loach with different thawing methods

不同解凍方式泥鰍肉樣T2的變化見(jiàn)表5。微波解凍后，T20峰面積增加，室溫解凍、4 ℃解凍、流水解凍和超聲解凍的結(jié)合水消失。從T21、T22峰頂點(diǎn)時(shí)間來(lái)看，除超聲解凍外，其余解凍方式到達(dá)峰頂點(diǎn)的時(shí)間均延遲；從T21的峰面積來(lái)看，除流水解凍外，其他解凍方式樣品的不易流動(dòng)的水均有不同程度的下降；從T22的峰面積來(lái)看，流水解凍和超聲解凍的峰面積顯著增加，室溫解凍、4 ℃解凍、微波解凍的峰面積減少。超聲解凍的T22面積最大，可能與超聲的機(jī)械效應(yīng)有關(guān)，機(jī)械效應(yīng)可將部分不易流動(dòng)的水轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，成為自由水。從T2總面積來(lái)看，解凍后總面積均減少，其中微波解凍的損失最高，流水解凍的損失最小，這與本文之前的解凍損失率研究結(jié)果相一致。利用LF-NMR可研究物料中的水分分布和流動(dòng)性情況[25]。解凍后，微波的T20峰右移并且峰面積有所增加，這可能是由于微波加強(qiáng)了水與蛋白質(zhì)之間的相互交聯(lián)作用，使部分水轉(zhuǎn)變成結(jié)合水。通過(guò)對(duì)5種解凍方式水分分布和研究發(fā)現(xiàn)，流水解凍魚肉樣品的水分分布與新鮮樣品最為接近，其余樣品均表現(xiàn)出不易流動(dòng)水向自由水遷移的現(xiàn)象，這與其他方式高解凍損失、蒸煮損失、超微結(jié)構(gòu)等指標(biāo)呈現(xiàn)高度相關(guān)。

表5 不同解凍方式泥鰍肉樣橫向弛豫時(shí)間的變化Tab.5 Changes of loach transverse relaxation time in different thawing methods

3 結(jié) 論

解凍方式對(duì)泥鰍肌肉纖維結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)具有顯著影響，肌漿蛋白溶解度可作為評(píng)價(jià)解凍后泥鰍質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。流水解凍的解凍損失率、蒸煮損失率最小，解凍后魚肉的pH值、橫向馳豫時(shí)間總面積與新鮮魚肉無(wú)顯著差別，解凍后的泥鰍肌肉纖維排列緊密。微波解凍時(shí)間最短，但對(duì)魚肉品質(zhì)影響最大，水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失嚴(yán)重。超聲波的應(yīng)用可加快解凍速率，促進(jìn)泥鰍肌肉中鹽溶性蛋白質(zhì)溶解，但是超聲波處理后泥鰍肌肉纖維的間隙變大，持水力下降。相比于4 ℃空氣解凍、微波解凍、超聲解凍、室溫解凍，流水解凍是冷凍泥鰍的較佳解凍方式。本研究對(duì)不同解凍方式的冷凍泥鰍肌肉組織理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，各種因素對(duì)不同解凍方式的影響規(guī)律有待于進(jìn)一步深入研究。