紫花苜蓿和鴨茅混合青貯貯藏過程中發(fā)酵品質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化

羅攖寧 羅 盈 李文麒 徐生陽 吳 哲 玉 柱

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100193）

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）又稱“牧草之王”，是多年生豆科牧草，具有高產(chǎn)量、高蛋白等特性，是畜牧業(yè)中重要的優(yōu)質(zhì)牧草資源[1]。鴨茅（Dactylis glomer?ata L.）是一種分蘗能力極強(qiáng)的叢生性禾草，地上生物量大，葉量豐富，是建植苜?；觳ゲ莸氐睦硐牒滩輀2]。紫花苜蓿和鴨茅混播能改善紫花苜蓿持久種植導(dǎo)致生產(chǎn)力降低的問題[3-4]。牧草青貯能有效保持草產(chǎn)品的鮮嫩多汁和豐富養(yǎng)分，改善飼料適口性[5-6]。但紫花苜蓿高蛋白的營養(yǎng)特點(diǎn)使原料具備較高緩沖性能，低含糖量使青貯過程中發(fā)酵底物不足[7-8]。鴨茅作為高葉量禾本科牧草，含有大量可溶性碳水化合物，可為青貯發(fā)酵提供豐富底物[9]。紫花苜蓿和鴨茅混合青貯能提升牧草青貯發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值[10-11]。

目前已有大量研究表明禾本科牧草與豆科牧草混合青貯可改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，但關(guān)于添加劑對禾本科牧草與豆科牧草混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的動(dòng)態(tài)影響的研究較少，基于此，本試驗(yàn)在前人對紫花苜蓿和鴨茅混播草地和混合青貯的研究基礎(chǔ)上，測定不同添加劑處理下紫花苜蓿和鴨茅混合青貯的整個(gè)青貯過程中不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵品質(zhì)，揭示其青貯過程中不同發(fā)酵階段發(fā)酵品質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化特征及添加劑對其影響，以期為苜蓿鴨茅混合青貯發(fā)酵機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用牧草原料取自云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院試驗(yàn)示范基地。紫花苜蓿品種為三得利，鴨茅品種為豐收，分別于現(xiàn)蕾前和抽穗前收獲（2019 年9 月25 日）。選用的添加劑：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）、糖蜜（T）、植物乳桿菌+糖蜜（LP+T）。植物乳桿菌由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草產(chǎn)品加工與貯藏實(shí)驗(yàn)室篩選，糖蜜購于北京廣達(dá)試劑公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以紫花苜蓿和鴨茅混播牧草為原料，混合收獲后用鍘草機(jī)鍘碎至1～2 cm。設(shè)置四個(gè)處理組：植物乳桿菌（LP）組、糖蜜（T）組、植物乳桿菌+糖蜜（LP+T）組和對照組（CK）。植物乳桿菌添加量均為1×106CFU/g鮮重；糖蜜的添加量是1%鮮重；植物乳桿菌+糖蜜的混合比例為1∶1，添加為1%鮮重。室溫下保存，青貯1、3、7、15、30、45、60 d 后開袋取樣分析測定發(fā)酵品質(zhì)，每次每處理開3袋作重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青貯調(diào)制

選用袋裝青貯法，將紫花苜蓿和鴨茅混收牧草原料與添加劑（對照組為等量蒸餾水）充分混勻后，取250 g裝入聚乙烯袋(45 cm×30 cm)，用真空包裝機(jī)抽真空封口。每個(gè)處理21個(gè)袋，共84袋。室溫條件下貯藏。

1.3.2 感官評定

依據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《青貯飼料質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)》[12]，從色澤、氣味、質(zhì)地和霉變等方面對青貯飼料的品質(zhì)進(jìn)行評定。

1.3.3 發(fā)酵品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室評定

開袋后采用五點(diǎn)取樣法稱取20 g青貯飼料，加入180 ml蒸餾水，攪拌均勻后用組織搗碎機(jī)攪碎1 min，先用4層紗布濾去殘?jiān)?，再用定性濾紙過濾得到浸出液。此浸出液用來測定pH 值和有機(jī)酸含量。pH 值用METTLER TOLEDO 型pH 計(jì)測定，用SHIMADZE-10A型高效液相色譜分別測定乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）含量，色譜柱為Shodex Rspak KC-811 S-DVB gel Column（shimadzu，日本），檢測器為SPD-M10AVP，流動(dòng)相：3 mmol/l 高氯酸，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量5 μl[13]。氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測定[14]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2019 進(jìn)行整理，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25 進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's 法對各數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。采用Python 3.4的matplotlib庫進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官判定

青貯45 d 之后，各處理組青貯料呈黃綠色，無霉變或粘手現(xiàn)象發(fā)生，質(zhì)地較好，T組和LP+T 組具較濃酸香味，CK組和LP組有輕微腐臭味。

2.2 紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的動(dòng)態(tài)

2.2.1 pH值（見圖1）

圖1 紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料pH值動(dòng)態(tài)變化

整個(gè)青貯過程中各處理組pH值均在貯藏前45 d變化較大，45 d 之后趨于穩(wěn)定。60 d 時(shí)，T 組和LP+T 組pH 值最低，分別達(dá)到5.48 和5.44，與CK 組相比，分別下降了14.51%和15.13%。各處理間T 組和LP+T組pH值顯著低于LP組與CK組（P＜0.05）。

2.2.2 乳酸含量（見圖2）

所有處理組乳酸含量在貯藏前7 d 增加迅速，之后出現(xiàn)小幅降低，LP組和T組乳酸含量在貯藏15 d后又開始升高，CK組和LP+T組30 d后開始升高。30 d時(shí)，CK組和LP+T組乳酸含量最低，LP組最高，T組次之。60 d時(shí)乳酸含量最高，各組間無顯著性差異。

2.2.3 乙酸含量（見圖3）

整個(gè)青貯過程所有處理組乙酸含量變化趨勢均呈現(xiàn)兩次先增后降，兩次乙酸含量的大幅增加都出現(xiàn)在最初15 d和30 d之后。貯藏前30 d各組間乙酸含量無顯著差異，30 d 后LP+T 組和T 組乙酸含量顯著高于CK組和LP組（P＜0.05），LP組乙酸含量最低。

圖2 紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料乳酸含量動(dòng)態(tài)變化

圖3 紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料乙酸含量動(dòng)態(tài)變化

2.2.4 丙酸含量（見圖4）

圖4 紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料丙酸含量動(dòng)態(tài)變化

整個(gè)青貯過程各組丙酸含量變化均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，青貯30 d時(shí)丙酸含量最高，其中CK組顯著高于其他組，T 組丙酸含量最低。30 d之后各處理組丙酸含量逐漸降低，45 d 時(shí)趨于穩(wěn)定，之后各組間丙酸含量無顯著性差異。

2.2.5 丁酸含量（見圖5）

圖5 紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料丁酸含量動(dòng)態(tài)變化

整個(gè)青貯過程中，各組丁酸含量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，CK組和T組在7 d和30 d丁酸含量較高，CK組和LP+T組在30 d丁酸含量較高，LP組和T組較低。45 d之后各組均未檢測到丁酸。15～45 d各組中CK組和LP+T組丁酸含量顯著高于LP組和T組（P＜0.05），LP組整個(gè)青貯過程丁酸含量都處于較低水平。

2.2.6 氨態(tài)氮含量（見圖6）

圖6 紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料氨態(tài)氮含量動(dòng)態(tài)變化

青貯前45 d，LP組和CK 組變化趨勢一致，前7 d迅速升高后降低，青貯30 d后又開始升高，且LP組和CK 組氨態(tài)氮含量顯著高于T 組和LP+T 組（P＜0.05）。青貯45 d后LP處理組氨態(tài)氮含量迅速下降，T、LP+T組和CK組氨態(tài)氮含量持續(xù)升高。30 d時(shí)，T組氨態(tài)氮含量最低。60 d時(shí)，LP組和T組氨態(tài)氮含量最低，與CK組相比下降3.26%和35.40%。

3 討論

3.1 植物乳桿菌對紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

乳酸菌對青貯的發(fā)酵過程至關(guān)重要，牧草植物體表面本身附著有一定數(shù)量天然乳酸菌，在調(diào)制青貯過程中添加乳酸菌制劑能加快乳酸發(fā)酵進(jìn)程的啟動(dòng)，快速產(chǎn)酸以降低pH值，營造適宜乳酸發(fā)酵的環(huán)境，從而提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和質(zhì)量[15-16]。司華哲[17]關(guān)于不同乳酸菌對紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)影響的研究結(jié)果表明，植物乳桿菌能有效降低pH 值且在青貯初期提高乳酸含量。本試驗(yàn)結(jié)果與該研究類似，添加植物乳桿菌的苜蓿鴨茅混合青貯pH 值、乙酸、丁酸、氨態(tài)氮降低，且青貯前7 d，植物乳桿菌組乳酸含量增加最迅速，含量最高。乙酸具有很強(qiáng)的抗真菌能力，低濃度的乙酸能提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性防止變質(zhì)，含量過高則會(huì)降低青貯飼料的適口性和家畜采食量。Kaiser等[18]提出的新青貯發(fā)酵品質(zhì)評定標(biāo)準(zhǔn)以青貯飼料中丁酸和乙酸的含量作為評價(jià)飼草青貯發(fā)酵品質(zhì)的指標(biāo)，并將3.0% DM的乙酸作為青貯料無氧穩(wěn)定性的上限。本試驗(yàn)中，植物乳桿菌組乙酸含量最低，與陶蓮等[19]關(guān)于華北駝絨藜青貯貯藏過程中發(fā)酵品質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的研究結(jié)果一致。分析可能的原因是植物乳桿菌作為同型乳酸發(fā)酵菌，乳酸轉(zhuǎn)化效率高，因此異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)物乙酸的含量降低。青貯45 d之后植物乳桿菌組氨態(tài)氮含量迅速降低，這與前人研究[20-21]中乳酸菌作為青貯發(fā)酵前期主要菌種，乳桿菌作為發(fā)酵后期主要菌種的結(jié)果相符。綜上說明乳酸菌制劑的使用可在青貯前期加速乳酸產(chǎn)生，同時(shí)降低發(fā)酵過程中的乙酸和氨態(tài)氮含量，改善苜蓿鴨茅混合青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。

3.2 糖蜜對紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

可溶性碳水化合物（WSC）是青貯過程中的發(fā)酵底物，原料含糖量豐富可加速青貯早期乳酸菌的繁殖促進(jìn)pH值降低，進(jìn)而形成穩(wěn)定的發(fā)酵環(huán)境，抑制有害微生物生長，降低發(fā)酵過程中由于不良微生物活動(dòng)導(dǎo)致的養(yǎng)分損失。因此，在青貯調(diào)制過程中添加糖蜜不僅可以改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)還能有效降低干物質(zhì)損失[22]。孫肖慧等[23]研究添加糖蜜對燕麥和紫花苜?；旌锨噘A的影響，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，添加糖蜜組乳酸含量升高，pH 值、乙酸含量和氨態(tài)氮占總氮比降低。Weinberg等[24]的研究結(jié)果表明3.0%(鮮重)的糖蜜添加量能有效改善橄欖的青貯品質(zhì)，獲得較高的乳酸含量和乳酸菌數(shù)量，當(dāng)糖蜜添加量更高時(shí)，酵母菌數(shù)量增加，會(huì)導(dǎo)致更多發(fā)酵損失。丁酸是發(fā)酵過程中梭菌的產(chǎn)物，而氨態(tài)氮意味著蛋白質(zhì)和氨基酸的分解，因此優(yōu)質(zhì)青貯飼料應(yīng)該具有較低含量的氨態(tài)氮，且不含丁酸[25]。而紫花苜蓿作為高蛋白豆科牧草，在青貯發(fā)酵的整個(gè)過程中幾乎都伴隨著蛋白的水解反應(yīng)，且在青貯前期最為劇烈[26]。本試驗(yàn)中，糖蜜組pH值、丙酸、丁酸含量和氨態(tài)氮含量較CK 組低，且青貯30 d 和60 d時(shí)，T組氨態(tài)氮含量均為最低，說明添加糖蜜能快速降低青貯pH值，抑制苜蓿和鴨茅混合青貯早期的蛋白水解反應(yīng)，減少氨態(tài)氮的生成，對紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料發(fā)酵過程中蛋白保存率的提高效果明顯。

3.3 植物乳桿菌和糖蜜混合添加對苜蓿鴨茅混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

董志國等[27]關(guān)于復(fù)合添加劑對苜蓿裹包青貯效果影響的研究結(jié)果表明乳酸菌劑和糖蜜復(fù)合處理能顯著降低pH 值和氨態(tài)氮含量，且不含丁酸。劉輝等[28]的研究結(jié)果表明，乳酸菌和糖蜜組合添加顯著降低了青貯飼料的pH 值和氨態(tài)氮占總氮比，顯著提高了乳酸含量和干物質(zhì)回收率，但與單獨(dú)添加菌劑相比，混合添加處理下的苜蓿青貯飼料各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)和化學(xué)成分均無顯著差異。本試驗(yàn)中，植物乳桿菌+糖蜜混合添加組的pH 值、丙酸含量最低，青貯前45 d LP+T組對氨態(tài)氮含量降低效果明顯，且青貯60 d時(shí)，LP+T組乳酸含量顯著高于植物乳桿菌和糖蜜單獨(dú)添加組，說明植物乳桿菌和糖蜜混合添加處理能一定程度上改善苜蓿鴨茅混合青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。

4 結(jié)論

①單獨(dú)添加植物乳桿菌能有效降低紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料中的乙酸含量。

②單獨(dú)添加糖蜜和混合添加植物乳桿菌+糖蜜對降低pH值和氨態(tài)氮含量效果最佳。

③添加糖蜜青貯30 d時(shí)紫花苜蓿和鴨茅混合青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)最佳，此時(shí)pH 值和氨態(tài)氮含量最低，乙酸、丙酸、丁酸含量較低，乳酸含量較高。