花鱸病毒感染后qPCR 內(nèi)參基因的篩選與應(yīng)用

楊宏偉 劉振興 郝 樂 馬江耀 梁志凌 馬艷平 曹俊明

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實驗室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站，廣東廣州510640；3.廣東海洋大學(xué)，廣東湛江524088)

花鱸（Lateolabrax maculatus）屬鱸形目（perci?formes），鮨科（serranidae），花鱸屬（Lateolabrax），據(jù)《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》數(shù)據(jù)，2019年我國花鱸年產(chǎn)量超過18.02萬噸，是我國重要性經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類[1-2]。近年來我國花鱸養(yǎng)殖密度不斷提高，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，傳染性疾病給花鱸養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3]。本實驗室前期從患病花鱸中分離、鑒定了一株虹彩病毒，主要衣殼蛋白基因（MCP）以及ATP 酶基因（ATPase）的進(jìn)化分析表明，該病毒屬虹彩病毒科（iri?doviridae），細(xì)胞腫大病毒屬（Megalocytivirus），與真鯛虹彩病毒（red sea bream iridovirus，RSIV）表現(xiàn)出較高的同源性[4]。細(xì)胞腫大病毒屬病毒的宿主范圍極為廣泛，造成了花鱸、真鯛（Pagrus major）[5]、斑石鯛（Opleg?nathus punctatus）[6]和尖吻鱸（Lates calcarifer）[7]等養(yǎng)殖魚類的巨大經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。

qPCR是基因定量表達(dá)研究中最常用和最有效的工具[10]。在qPCR技術(shù)中，選擇合適的內(nèi)參基因至關(guān)重要。而目前的研究中內(nèi)參基因往往未經(jīng)驗證就作為穩(wěn)定內(nèi)參用于相關(guān)試驗之中[11-12]。為減小試驗誤差，需要選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)υ囼灁?shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化處理，以獲得更為準(zhǔn)確的基因表達(dá)變化數(shù)值[13]。

RNA 聚 合 酶Ⅱ（RNA polymerase II，RNAPoLⅡ）、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine gua?nine phosphoribosyl transferase1，HPRT）、α微管蛋白（α-Tubulin，TUBA）、β肌動蛋白（β-Actin，ACTB）、18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）、β2-微球蛋白（β-2-microglobulin，B2M）、延伸因子1α（elon?gation factor-1-α，EF1A）及核糖體蛋白L7（ribosomal protein L7，RPL7）作為內(nèi)參基因獲得廣泛應(yīng)用[14-16]。在抗病毒飼料研究中，qPCR 技術(shù)也成為評價飼料抗病毒效果以及揭示抗病毒機(jī)制的重要手段。例如，孫博超等[17]、孫艷等[18]開展的益生菌飼料抗白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）研究中，以EF-α、ACTB 作為內(nèi)參基因分析了凡納濱對蝦（Lito?penaeus vannamei）免疫基因表達(dá)規(guī)律，進(jìn)一步評價含益生菌飼料的保護(hù)作用[17-18]；以GAPDH為內(nèi)參基因研究了日糧中添加枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對櫻桃谷肉鴨免疫相關(guān)基因的表達(dá)，闡明了益生菌飼料的保護(hù)機(jī)制[19]。目前，花鱸在不同鹽度應(yīng)激條件下的內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行了比較研究[15]，但LMIV 感染后花鱸候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性尚不清楚，影響了通過qP?CR方法分析花鱸免疫相關(guān)基因的表達(dá)以及病毒增殖的研究，也制約了抗病毒飼料的評價。

本研究在花鱸人工感染LMIV后選取花鱸腦、鰓、肝、脾、頭腎、后腎、肌肉、中腸、胃、胸鰭、心和腎細(xì)胞共12 個組織/細(xì)胞，分別采用GeNorm、NormFinder、Best?Keeper軟件[20-22]對RNAPoL Ⅱ、HPRT、TUBA、ACTB、18S rRNA、B2M、EF1A、RPL7內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。以篩選的內(nèi)參基因為基礎(chǔ)建立qPCR 方法，對病毒ORF92R、ORF101R、ORF407R、ORF543R基因的表達(dá)進(jìn)行分析[23]，進(jìn)一步評估了RNAPoL Ⅱ、RPL7作為病毒感染后穩(wěn)定內(nèi)參基因的可靠性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康花鱸（15±1）g 由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所惠贈，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1 周，水溫保持在25～30 ℃，期間采用PCR方法進(jìn)行虹彩病毒檢測[4]。LMIV 由本研究室分離并保存，花鱸腎細(xì)胞系（K2）由本研究室建立并保存[4]。

1.2 樣品采集

隨機(jī)選取12 尾花鱸分為攻毒組和對照組(6 尾/組)。攻毒組腹腔注射K2 細(xì)胞增殖的LMIV（100 TCID50/100 μl），對照組腹腔注射L-15 培養(yǎng)基（Gibco）。待攻毒花鱸出現(xiàn)體色發(fā)黑、游動異常等發(fā)病癥狀時（90 h），對攻毒及對照組花鱸分別取樣?；|用50 μl/l 丁香酚（eugenol）麻醉后，分離腦、鰓、肝、脾、頭腎、后腎、肌肉、中腸、胃、胸鰭和心臟組織，置于無RNA酶離心管，保存于液氮備用。LMIV感染K2細(xì)胞90 h后取樣并保存于液氮。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

按照Total RNA Kit II（OMEGA）操作說明書，提取上述12 個組織的總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸檢測儀確定RNA 的質(zhì)量與濃度。取1 μg RNA 按照HiScript?II 1st Strand cDNA Syn?thesis Kit (+gDNA wiper)試劑盒(Vazyme)說明書進(jìn)行cDNA合成。

1.4 引物設(shè)計及合成

RNAPoL Ⅱ、HPRT、TUBA、ACTB、RPL7、18S rRNA、B2M、EF1A 8個候選內(nèi)參基因序列引用自Wang等[15]，由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。根據(jù)RSIV（GenBank：AB104413.1）序列設(shè)計引物（表2），擴(kuò)增LMIV的ORF92R、ORF101R、ORF407R和ORF543R。

表1 內(nèi)參基因引物序列

表2 LMIV 引物序列

1.5 基因的擴(kuò)增及克隆載體構(gòu)建

以1.3 節(jié)制備的cDNA 為模板，采用1.4 節(jié)中合成的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。取5 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測；其余PCR產(chǎn)物采用AXYGEN PCR Cleanup Kit 試劑盒純化，純化產(chǎn)物連接pMD-18T載體（Takara），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞。篩選PCR 陽性克隆菌株送廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序。測序后，將包含上述載體的Top10擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。

1.6 qPCR 方法建立以及內(nèi)參基因、病毒基因的表達(dá)分析

提取1.5 節(jié)中成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒，核酸定量后制備標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]，計算擴(kuò)增效率（E 值）。采用建立的qPCR 方法，分析1.2 節(jié)樣品中內(nèi)參基因、病毒基因的表達(dá)。qPCR 體系參照AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix 說明書，擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)；產(chǎn)物進(jìn)行融解曲線分析：95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s。每個樣本設(shè)3個技術(shù)重復(fù)。

1.7 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的軟件分析

采用GeNorm、NormFinder、BestKeeper 軟件分析1.6中qPCR結(jié)果（cycle threshold，Ct值）。每組基因的所有樣品的Ct值減去該組基因樣品中最小的Ct值，得到△Ct值并轉(zhuǎn)換成相對表達(dá)量2-△Ct值[25]。將2-△Ct導(dǎo)入GeNorm軟件，通過每組基因樣品的相對表達(dá)量2-△Ct計算候選基因的平均表達(dá)穩(wěn)定度（M），M值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定，以此篩選出穩(wěn)定的兩個基因，并引入內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異Vn/n+1值來判斷攻毒組和對照組中最合適的內(nèi)參基因個數(shù)，如果Vn/n+1大于0.15，內(nèi)參基因最合適的個數(shù)為n+1個，若Vn/n+1小于0.15，則最合適內(nèi)參基因個數(shù)應(yīng)為n[26]。NormFinder軟件分析與GeNorm軟件相似，將相對表達(dá)量2-△Ct值導(dǎo)入，得出表明穩(wěn)定程度的S值，S值越小內(nèi)參基因越穩(wěn)定。BestKeeper軟件根據(jù)SD值和CV值作為第一次評估標(biāo)準(zhǔn)[14]，即SD值＜1，且越小則內(nèi)參基因越穩(wěn)定；再根據(jù)基因之間的相關(guān)系數(shù)（r），以及p（p-value）值進(jìn)一步篩選出相關(guān)性基因組合。最后根據(jù)GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件的排序結(jié)果，對內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行綜合排序。

1.8 穩(wěn)定性內(nèi)參基因的應(yīng)用

準(zhǔn)備5瓶長至80%～90%融合度的K2細(xì)胞，0.05%胰酶（Gibco）消化，L-15 培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，2 ml/孔接種至12 孔板，26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁并長至75%融合度后，加入200 TCID50LMIV 病毒液（200 μl/孔），設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)，分別在10、24、48、72、96 h和120 h收集細(xì)胞，參照1.3節(jié)提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以1.7節(jié)篩選的穩(wěn)定表達(dá)的基因作為內(nèi)參，采用1.6 節(jié)建立的qPCR 方法分析ORF92R、ORF101R、ORF407R、ORF543R基因的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 花鱸攻毒結(jié)果

PCR 結(jié)果顯示實驗所用魚未感染虹彩病毒。花鱸攻毒24 h 后體色變黑，游動緩慢，解剖觀察發(fā)現(xiàn)脾臟腫大。采集脾組織提取DNA 進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果呈陽性（圖1）。

圖1 攻毒組和對照組花鱸脾LMIV檢測電泳圖

2.2 引物特異性分析

本實驗擴(kuò)增的8 個花鱸候選內(nèi)參基因以及4 個LMIV基因的PCR產(chǎn)物測序后進(jìn)行Blast比對確定為目的片段；8個內(nèi)參基因以及4個病毒基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線均為單峰(圖2)，擴(kuò)增效率均在96%～102%(表3)。

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1 GeNorm軟件分析

GeNorm分析顯示8個候選基因在正?；|不同組織/細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定性為：RNAPoL Ⅱ=RPL7＞18S rRNA＞HPRT＞ACTB＞B2M＞TUBA＞EF1A，其中RNAPoL Ⅱ和RPL7是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；攻毒后8個內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性為：RNAPoL Ⅱ=HPRT＞RPL7＞TUBA＞ACTB＞18S rRNA＞B2M＞EF1A，其中RNAPoL Ⅱ和HPRT的M值最小，是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，EF1A 表達(dá)穩(wěn)定性最差(圖3A)；根據(jù)配對變異Vn/n+1值可以篩選多個內(nèi)參基因，最小配對變異值V2/3＞0.15，且V3/4＜0.15，因此選取3個內(nèi)參基因(圖4)；因此在LMIV感染后選取3個內(nèi)參基因(圖4A)，即RNAPoL Ⅱ、RPL7及HPRT。

圖2 8個內(nèi)參基因及4個病毒基因熔解曲線

表3 基因擴(kuò)增效率

2.3.2 NormFinder軟件分析

NormFinder 軟件結(jié)果顯示18S rRNA在正?；|不同組織/細(xì)胞中表達(dá)最穩(wěn)定（圖5A），在攻毒后RPL7表達(dá)最穩(wěn)定，EF1A表達(dá)穩(wěn)定性最差（圖5B）。

2.3.3 BestKeeper軟件分析

BestKeeper 軟件分析結(jié)果表明攻毒組中，TUBA、ACTB、18S rRNA、B2M、EF1A基因的SD＞1，均不適合作為內(nèi)參基因使用，對照組中HPRT、TUBA、ACTB、B2M、EF1A基因的SD＞1，也不適合作為內(nèi)參基因。8個內(nèi)參基因在攻毒后花鱸不同組織/細(xì)胞中RPL7的SD值最?。?.68）；18S rRNA在對照組中SD值最?。?.66）（表4）。

圖3 GeNorm分析候選參考基因的平均表達(dá)穩(wěn)定值

圖4 Vn/n+1比值分析

2.3.4 綜合分析

多種算法結(jié)合分析篩選的穩(wěn)定內(nèi)參基因組合可以準(zhǔn)確校準(zhǔn)系統(tǒng)誤差。三種算法綜合分析正?；|中RNAPoL Ⅱ、18S rRNA、RPL7 基因表達(dá)相對穩(wěn)定；攻毒組中RNAPoL Ⅱ、RPL7、HPRT表達(dá)相對穩(wěn)定（表5）。

2.4 篩選的穩(wěn)定內(nèi)參基因評價LMIV增殖的研究

采用qPCR 方法選取穩(wěn)定表達(dá)的RNAPoL Ⅱ、RPL7及LMIV侵染后不穩(wěn)定表達(dá)的18S rRNA分別作為內(nèi)參基因分析LMIV ORF92R、ORF101R、ORF407R、ORF543R 的表達(dá)。結(jié)果表明，4 個病毒基因以RNAPoL Ⅱ、RPL7 為內(nèi)參其表達(dá)趨勢呈現(xiàn)更好的一致性，而以18S rRNA作為內(nèi)參其表達(dá)趨勢不穩(wěn)定、表達(dá)量波動較大（圖6）。

圖5 NormFinder分析候選參考基因的平均表達(dá)穩(wěn)定值

表4 BestKeeper分析結(jié)果

表5 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性綜合分析排名

3 討論

3.1 花鱸候選內(nèi)參基因在病毒感染后其表達(dá)穩(wěn)定性存在差異

研究表明選用單個內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化分析會導(dǎo)致相對較大的誤差，選用多個內(nèi)參基因進(jìn)行評價可以獲得更為準(zhǔn)確的歸一化因子[22]。內(nèi)參基因在不同物種和不同環(huán)境中表達(dá)穩(wěn)定性變化較大，可能是因為內(nèi)參基因不僅僅參與細(xì)胞基礎(chǔ)代謝還具有其他功能[27-29]。18S rRNA在機(jī)體各組織中表達(dá)量都很高，由于mRNA 變化相對較小，18S rRNA 經(jīng)常作為mRNA定量研究的內(nèi)參基因[30]。本研究結(jié)果顯示花鱸在感染LMIV前后，3個軟件分析結(jié)果顯示，18S rRNA在正?；|不同組織/細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定性均高于其他基因。18S rRNA是自然條件下花鱸不同組織中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[15]，這與本研究結(jié)果相似；在牙鲆的相關(guān)研究中，18S rRNA 是胚胎階段表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[31]。但在LMIV 感染后，GeNorm 和NormFinder 軟件結(jié)果顯示18S rRNA 表達(dá)穩(wěn)定性發(fā)生明顯變化。RNAPoL Ⅱ是編碼mRNA 轉(zhuǎn)錄的主要功能酶。RNAPoL Ⅱ在不同組織的mRNA轉(zhuǎn)錄中均能被檢測到并顯示出較低的轉(zhuǎn)錄變異，是最合適的內(nèi)參基因[32]；上述結(jié)論與本研究結(jié)果一致，花鱸感染LMIV 前后RNAPoL Ⅱ均表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，是LMIV 感染后表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在其他魚類，例如條石鯛（Oplegnathus fasciatus）[33]、大菱鲆（Scophthalmus maxi?mus）[34]中RNAPoL Ⅱ也是最合適的內(nèi)參基因。RPL7作為一種核糖體蛋白不僅參與蛋白質(zhì)合成，而且還參與細(xì)胞生長、分化、凋亡等[35]，與花鱸在鹽度脅迫中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性研究結(jié)果類似，在LMIV 感染前后RPL7均可作為穩(wěn)定內(nèi)參基因使用。病原感染后魚類的候選內(nèi)參基因表達(dá)可能出現(xiàn)較大變化，HPRT 在LMIV 感染前表達(dá)并不穩(wěn)定，但在感染后卻表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。穩(wěn)定內(nèi)參基因的篩選也可能面臨困難，例如條石鯛[33]、大菱鲆[34]、牙鲆（Paralichthys oliva?ceus）[36]等在細(xì)菌感染后，未能篩選出在所有組織中均能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

圖6 4個LMIV基因的表達(dá)

3.2 內(nèi)參基因在抗病毒功能飼料評價中的應(yīng)用

在水產(chǎn)抗病毒飼料的評價中，穩(wěn)定的內(nèi)參基因是準(zhǔn)確分析基因表達(dá)變化的基礎(chǔ)。投喂含復(fù)合芽孢桿菌飼料并用WSSV 感染凡納濱對蝦，選取EF-α作為內(nèi)參基因分析了含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(Cys?teinyl aspartate specific proteinase, Caspase)基因及硫氧還原蛋白(Thioredoxin, Trx)基因表達(dá)[17]；用益生菌飼料投喂選取ACTB 作為內(nèi)參分析了凡納濱對蝦血淋巴中酚氧化酶、超氧化物歧化酶及溶菌酶基因在WSSV刺激后的表達(dá)規(guī)律[18]；選取GAPDH作為穩(wěn)定內(nèi)參基因分析了櫻桃谷肉鴨投喂枯草芽孢桿菌飼料、用禽致病性大腸桿菌及新型鴨呼腸弧病毒（Novel duck reovirus，NDRV）感染后脾、胸腺中免疫基因的表達(dá)變化[19]。這些研究均為進(jìn)一步分析含益生菌飼料在抗病毒感染保護(hù)作用提供了科學(xué)依據(jù)。因此穩(wěn)定內(nèi)參基因的篩選可以為花鱸抗病毒飼料開發(fā)中檢測花鱸免疫基因表達(dá)及病毒增殖提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究采用GeNorm、NormFinder、BestKeeper 軟件對花鱸感染LMIV 前后適合qPCR 的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選并應(yīng)用于4 個LMIV 病毒基因表達(dá)分析，證實RNAPoL Ⅱ、RPL7基因可以作為穩(wěn)定內(nèi)參，為進(jìn)一步研究抗病毒飼料的作用效果及機(jī)制提供了基礎(chǔ)。