菌酶協(xié)同固體發(fā)酵玉米蛋白粉的條件優(yōu)化

史路路 陳國明 張家學(xué) 齊振雄

（廣東海大集團股份有限公司 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點實驗室，廣東廣州511400）

玉米蛋白粉是由玉米粒經(jīng)濕磨法工藝制得的粗淀粉乳，再經(jīng)淀粉分離機分離出的蛋白質(zhì)水，然后用離心機或氣浮懸法濃縮、脫水干燥制得[1]。其蛋白質(zhì)含量在60%以上，其余約為20%的淀粉和13%的纖維素及少量酯類、玉米黃素、葉黃素等[2]。玉米蛋白質(zhì)中主要是醇溶蛋白，其含量約占玉米總蛋白的68%，另外還含有22%的谷蛋白及少量球蛋白、白蛋白[3]。

目前國內(nèi)外學(xué)者對玉米蛋白粉的研究多采用酶解法、微生物發(fā)酵法或菌酶協(xié)同作用法等，以期提高原料中的可吸收性小肽、可溶性蛋白或粗蛋白質(zhì)的含量，與其他飼料原料搭配飼用，可達到良好的效果。胡海濱等[4]研究了在飼料中添加發(fā)酵玉米蛋白粉替代部分魚粉對卵形鯧鲹生長性能的影響，結(jié)果表明，在復(fù)合飼料中添加11.8%～17.3%的玉米蛋白粉能夠改善卵形鯧鲹的生長性能和飼料利用能力。何嬌嬌等[5]研究了發(fā)酵玉米蛋白粉替代魚粉對大黃魚生長、腸道組織結(jié)構(gòu)及腸道微生物菌群的影響，結(jié)果表明，大黃魚幼魚飼料中可以使用玉米蛋白粉來替代45%的魚粉，既不影響大黃魚幼魚的生長和存活，也不影響其腸道組織結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢菌群變化。苗國偉[6]對玉米蛋白粉進行了混菌固體發(fā)酵的工藝研究，發(fā)酵結(jié)束后，粗蛋白質(zhì)含量提高了7.33%，并在肉雞日糧中添加了該發(fā)酵玉米蛋白粉，研究結(jié)果表明，肉雞平均采食量有所提高，料重比顯著降低，試驗組腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量顯著減少，乳酸桿菌數(shù)量顯著提高，并且明顯增強了肉雞血清對羥自由基（·OH）和超氧自由基（O2-·）的清除能力。

玉米蛋白粉中存在著部分碳水化合物，如淀粉，不能被動物直接吸收利用，因此限制了其在高品質(zhì)飼料中的應(yīng)用。為提高玉米蛋白粉的綜合利用效率，利用微生物學(xué)方法，去除原料中的碳水化合物，從而增加其發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)的含量，使之成為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，在本研究中，采用“復(fù)合酶+酵母菌”的方式對玉米蛋白粉進行了固體好氧發(fā)酵，并取得了良好的效果，為玉米蛋白粉在畜禽、水產(chǎn)飼料方面的合理、有效利用提供了一種參考方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

飼料用酵母菌粉購于安琪酵母股份有限公司，活菌數(shù)2×1010cfu/g。

淀粉酶、糖化酶購于尤特爾生物技術(shù)有限公司。

玉米蛋白粉購于廣州海維飼料有限公司（粗蛋白含量60.27%）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗包括8 個單因素試驗和1 個正交試驗，分別篩選料水比例（1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8）、淀粉酶添加量（0、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%）、糖化酶添加量（0、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%）、酵母菌粉添加量（0、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%）、培養(yǎng)溫度（25、30、35、40 ℃）、培養(yǎng)時間（8、16、24、32、40 h）、初始pH值（pH 值自然，pH 值4.0、5.0、6.0、7.0）、料層厚度（2、4、6、8、10 cm），每個因素水平設(shè)置3個重復(fù)。對于影響結(jié)果顯著的淀粉酶、糖化酶粉、酵母菌粉和料水比例再進行四因素三水平L9（34）的正交試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗

玉米蛋白粉原料200.0 g，加入0.40%（與原料的比值，下同）的淀粉酶，0.20%糖化酶，0.20%酵母菌粉，料水比例1∶0.7，酶、菌分別溶于水中，攪拌均勻后，同時加入物料中，調(diào)整原料起始pH值至5.0～6.0，再將混合均勻的發(fā)酵料轉(zhuǎn)移至鋪有8 層無菌紗布的塑料筐內(nèi)，堆積高度為4～6 cm，在表層覆蓋8層無菌紗布，確保四周覆蓋嚴(yán)實后，置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)置發(fā)酵溫度為35 ℃，發(fā)酵時間24 h。

在上述各單因素恒定的基礎(chǔ)上，對需研究的因素按設(shè)計進行調(diào)整。

1.3.2 正交試驗

在1.3.1 得到的各單因素試驗結(jié)果中，利用SPSS 25.0軟件對各單因素試驗結(jié)果進行顯著性分析，得到淀粉酶、糖化酶、酵母菌粉和料水比例四個因素對結(jié)果的影響較為顯著。由此，設(shè)置了四因素三水平L9（34）的正交試驗（見表1）。

1.4 測定指標(biāo)及方法

將發(fā)酵樣品在80 ℃下烘干，粉碎后測定含水量、粗蛋白質(zhì)，以干物質(zhì)計粗蛋白質(zhì)含量。將玉米蛋白粉原料和在最適發(fā)酵條件下得到的樣品分別進行氨基酸含量的測定。粗蛋白質(zhì)含量按照GB/T 5009.5—2010的方法進行測定；含水量按照GB/T 5009.3—2016的方法測定；氨基酸含量按照GB/T 18246—2000的方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用EXCEL 2016 進行初步處理后，采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，檢驗組間差異顯著性，用Duncan's法進行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料水比例(見表2)

水分過低，營養(yǎng)物溶解性減少，底物顆粒膨脹程度低；水分過高，則通透性差，限制氣體和熱量的傳遞[7]。玉米蛋白粉吸水性能強，若水分過少，則原料不能充分吸水膨脹，影響發(fā)酵效果；水分過高，原料易出現(xiàn)成團現(xiàn)象，導(dǎo)致氣體難以均衡分布，不能實現(xiàn)均勻發(fā)酵，且烘干過程必將增加能耗。由表2及結(jié)合產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量及實際需求考慮，料水比例宜選擇為1∶0.6。

2.1.2 淀粉酶添加量(見表3)

表3 淀粉酶添加量對產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響

利用淀粉酶對淀粉進行酶解處理，能夠充分地去除玉米蛋白粉中殘留的淀粉[8]。由表3 可知，添加量為0～0.40%時，粗蛋白質(zhì)的含量與淀粉酶添加量成正比關(guān)系，表明淀粉酶降解了原料中的部分淀粉，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍缚衫玫奶窃镔|(zhì)，隨著淀粉被消耗，粗蛋白質(zhì)的含量逐步得到提高。當(dāng)添加量為0.40%時，繼續(xù)添加淀粉酶，粗蛋白質(zhì)的含量趨于穩(wěn)定。故宜選擇淀粉酶的添加量為0.40%。

2.1.3 糖化酶添加量(見表4)

糖化酶能從淀粉分子的非還原性末端水解α-1，4葡萄糖苷鍵，生成葡萄糖，供酵母生長、代謝利用。其與淀粉酶配合使用，能夠徹底降解原料中殘留的淀粉，從而使粗蛋白質(zhì)的含量得到進一步的濃縮。由表4可知，糖化酶的添加量宜為0.20%。

表4 糖化酶添加量對產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響

2.1.4 酵母菌粉添加量(見表5)

發(fā)酵料中加入酵母菌粉后，除可利用基質(zhì)大量合成自身所需要的菌體蛋白和細(xì)胞骨架，從而提高飼料中蛋白質(zhì)含量外，同時還可消耗一定量的糖類物質(zhì)，釋放出能量和二氧化碳，糖類物質(zhì)比例降低后，導(dǎo)致了基質(zhì)中蛋白質(zhì)的單位含量的增加[9]。在本研究中，玉米蛋白粉未經(jīng)高溫處理，整個發(fā)酵過程中原料均以生料狀態(tài)存在，有研究表明玉米蛋白粉生料可經(jīng)酵母的代謝作用產(chǎn)生酒精[10]。加入的酵母菌能夠利用酶解產(chǎn)生的糖類物質(zhì)，除生成酒精外，還能夠代謝產(chǎn)生芳香類物質(zhì)。發(fā)酵后的玉米蛋白粉具有濃烈的酵母香味，對畜禽增加食欲，增強消化吸收等有一定作用[11]。由表5 結(jié)果可知，酵母菌粉的添加量宜選擇0.20%。

表5 酵母菌粉添加量對產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響

2.1.5 培養(yǎng)溫度(見表6)

溫度是影響發(fā)酵成敗的一個重要因素，在適宜的溫度下，菌株生長代謝活動旺盛，且酶能夠發(fā)揮正常功效。如表6所示，25～35 ℃的溫度范圍內(nèi)，產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)的含量隨著溫度的上升呈緩慢增長趨勢。培養(yǎng)溫度高于35 ℃后，粗蛋白質(zhì)含量略有下降，故培養(yǎng)溫度選擇35 ℃左右為宜。

2.1.6 培養(yǎng)時間(見表7)

表6 溫度對產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量的影響

表7 培養(yǎng)時間對產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量的影響

由表7可知，固體好氧發(fā)酵初期，粗蛋白質(zhì)含量增加緩慢，當(dāng)發(fā)酵進行到第24 h時，延長發(fā)酵時間，粗蛋白質(zhì)含量趨于穩(wěn)定。綜合考慮，發(fā)酵時間宜選擇24 h。

2.1.7 初始pH值(見表8)

表8 不同初始pH值對產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量的影響

玉米蛋白粉原料呈酸性，pH 值在3.5～3.8 之間。由表8可知，當(dāng)初始pH值為5.0～6.0時，得到的產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量最高。原因在于，偏酸性環(huán)境下，有利于酵母菌的生長代謝及酶發(fā)揮自身活性。故在發(fā)酵前，應(yīng)將玉米蛋白粉原料的初始pH值調(diào)至5.0～6.0。

2.1.8 料層厚度(見表9)

表9 不同料層厚度對產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量的影響

料層的厚度影響著發(fā)酵料的氣體和熱量交換，料層較薄時，表層水分易散失，外層的物料難發(fā)酵透徹；料層較厚時，發(fā)酵料中心由于微生物呼吸產(chǎn)熱，不能及時散發(fā)出去，易形成內(nèi)部溫度高于設(shè)定的培養(yǎng)溫度的情況[12]，進而對發(fā)酵結(jié)果產(chǎn)生不良的影響。物料厚度低于4 cm時，表層物料水分有所散失，有效發(fā)酵物料質(zhì)量偏少，故得到的粗蛋白質(zhì)含量低；當(dāng)料層厚度超過6 cm后，由于物料中心溫度較高，不適合酵母菌的生長代謝，故發(fā)酵能力低。由表9 可知，在實驗室研究階段，玉米蛋白粉的厚度選擇4～6 cm 為宜。在大規(guī)模生產(chǎn)中，玉米蛋白粉堆積較厚時，可通過適時翻料，確保內(nèi)外部氣體和熱量的流通，避免“燒心”現(xiàn)象，實現(xiàn)均勻發(fā)酵。

2.2 正交試驗結(jié)果(見表10～表11)

表10 正交試驗結(jié)果

由表10可知，經(jīng)過正交表極差分析，各發(fā)酵因素對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量的影響主次順序為B＞A＞C＞D，即糖化酶＞淀粉酶＞酵母菌＞料水比例。進一步的方差分析結(jié)果由表11 可知，四個發(fā)酵因素對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)的含量沒有顯著影響（P＞0.05）。因此，本次試驗中淀粉酶、糖化酶、酵母菌粉和料水比例的最佳組合為A1B3C3D1，即淀粉酶添加量0.20%、糖化酶添加量0.30%、酵母菌粉添加量0.30%、料水比例1∶0.6，按照該最佳組合進行多次重復(fù)試驗，得到的發(fā)酵產(chǎn)物中，粗蛋白質(zhì)的平均含量為72.35%，高于正交試驗中的最佳結(jié)果，可作為玉米蛋白粉發(fā)酵的最適條件。

表11 方差分析結(jié)果

2.3 發(fā)酵前后氨基酸含量的變化

比較玉米蛋白粉原料和經(jīng)最適發(fā)酵條件得到的產(chǎn)物中的氨基酸種類及含量，如表12所示，發(fā)酵后的總必需氨基酸和總氨基酸分別增加了20.43%、18.88%。在菌酶協(xié)同作用的發(fā)酵結(jié)果中，必需氨基酸中的賴氨酸和纈氨酸含量增加比例較大，分別比發(fā)酵前增加了31.30%、28.19%；非必需氨基酸中的組氨酸和絲氨酸分別比發(fā)酵前增加了27.13%、23.62%。

3 討論

玉米蛋白粉來源豐富、價格低廉，蛋白質(zhì)含量高，可達60%以上，但蛋白中醇溶蛋白比例高，蛋白質(zhì)水溶性差、氨基酸組成不平衡。目前對玉米蛋白粉的研究中，主要是利用單一菌種或復(fù)合菌種來進行固體發(fā)酵。佟維娜等[13]采用羊肚菌對玉米蛋白粉進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，含水量65%、接種量14%、培養(yǎng)溫度25 ℃、初始pH 值6.0、發(fā)酵時間20 d，得到蛋白轉(zhuǎn)化率為22.36%，發(fā)酵后親水性氨基酸提高了12.75%。魏炳棟等[14]選用地衣芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和黑曲霉為復(fù)合菌，接種量分別為4%、4%、6%、6%，發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間84 h、含水量45%、初始pH 值6.0，發(fā)酵后，多肽得率為44.03%，粗蛋白質(zhì)含量提高了15.17%，總必需氨基酸和總氨基酸含量分別增加了12.58%和12.37%。菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料是以國家相關(guān)法規(guī)允許的飼料原料、酶制劑和微生物，通過發(fā)酵工程和酶工程技術(shù)協(xié)同作用生產(chǎn)的單一飼料和混合飼料。玉米蛋白粉中含有15%～21%的淀粉，通過微生物與復(fù)合酶的協(xié)同作用，進行一系列的降解與轉(zhuǎn)化，最終可達到蛋白濃縮的目的。本試驗中，采用酵母菌、淀粉酶和糖化酶混合的協(xié)同方式，使玉米蛋白粉中粗蛋白質(zhì)含量達到72.35%，在原料的基礎(chǔ)上提高了20.04%，高于目前所見固體發(fā)酵中相關(guān)文獻的報道值。在液體發(fā)酵中，雖有粗蛋白質(zhì)含量高達74.47%的報道，如吳澤柱[15]采用液體發(fā)酵的方式處理玉米蛋白粉，玉米蛋白粉4%，pH值6.0，接種量3%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵72 h 后，蛋白水解度為16.72%，粗蛋白質(zhì)含量74.47%，但使用液體發(fā)酵法處理玉米蛋白粉，受烘干成本高及利潤相對較低等因素制約，并不適用于在中小飼料企業(yè)推廣。

表12 氨基酸檢測結(jié)果

目前玉米蛋白粉產(chǎn)品仍存在著醇溶蛋白含量較高、可被動物直接吸收利用的小肽含量相對較低等問題，如何降解玉米蛋白粉中的醇溶蛋白、提高可吸收小肽含量以及驗證發(fā)酵后的產(chǎn)物在畜禽、水產(chǎn)方面的飼用效果，將作為下一步的研究重點。

4 結(jié)論

經(jīng)過單因素和正交試驗，得到了玉米蛋白粉的最適發(fā)酵條件為：淀粉酶0.20%、糖化酶0.30%、酵母菌粉0.30%、料水比例1∶0.6，初始pH 值5.0～6.0、發(fā)酵溫度35 ℃，料層厚度為4～6 cm，好氧發(fā)酵24 h。在該條件下得到的發(fā)酵產(chǎn)物中，粗蛋白質(zhì)含量從60.27%提升至72.35%，提高了20.04%，且發(fā)酵后的總必需氨基酸和總氨基酸分別增加了20.43%、18.88%。