低氧環(huán)境對(duì)椎間盤自發(fā)性吸收的影響及其作用機(jī)制

盧巖凱 陳宏亮 袁峰 陳聆華 谷濤 邵禮暉 范煜昕

臨床上大部分腰椎間盤突出癥患者通過(guò)保守治療后可獲得較為令人滿意的生活質(zhì)量。但是，對(duì)腰椎間盤大塊突出患者，尤其是當(dāng)突出物對(duì)硬膜囊的壓迫超過(guò)1/3使神經(jīng)根受到明顯擠壓時(shí)，手術(shù)治療效果更好[1]。隨著醫(yī)學(xué)影像學(xué)的發(fā)展，腰椎間盤大塊突出組織自發(fā)性吸收的相關(guān)報(bào)道越來(lái)越多[2-3]。腰椎間盤突出組織自發(fā)性吸收可以被認(rèn)為是腰椎間盤突出癥的自然轉(zhuǎn)歸，但臨床上這一現(xiàn)象的發(fā)生仍有偶然性。關(guān)于是否存在促進(jìn)椎間盤組織自發(fā)性吸收的微環(huán)境及其作用機(jī)制目前仍不明確。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑。在缺氧條件下，其調(diào)節(jié)亞基缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的降解受到阻礙，在細(xì)胞中迅速聚集[4]。同時(shí)，HIF-1α的活性增強(qiáng)，移至細(xì)胞核，與HIF-1結(jié)合并形成活化的HIF-1蛋白質(zhì)。HIF-1參與細(xì)胞存活和凋亡的平衡調(diào)節(jié)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮的作用隨細(xì)胞類型不同而變化[5]。在不同細(xì)胞中，HIF-1顯示出促進(jìn)或抵抗細(xì)胞凋亡的不同效果。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是具有選擇性水滲透性的膜通道蛋白質(zhì)家族，與晶狀體的主要內(nèi)在蛋白質(zhì)同源[6]。在缺氧條件下水通道蛋白3(AQP3)的表達(dá)下降，而在復(fù)氧后會(huì)增加[7]。本研究在不同時(shí)效低氧環(huán)境下培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞，觀察各組髓核細(xì)胞中HIF-1α、3 型酸敏感離子通道(acid-sensing ionchannel 3，ASIC3)及AQP3的表達(dá)，通過(guò)對(duì)髓核細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)探討促進(jìn)自發(fā)性吸收的最優(yōu)環(huán)境及其可能機(jī)制，以期為臨床腰椎間盤突出癥的保守治療提供依據(jù)。

資料和方法

一、資料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)成年日本大耳兔9只(南昌龍平兔業(yè)有限公司，中國(guó))，雌雄不限，平均體質(zhì)量2 kg。實(shí)驗(yàn)在深圳中洪博遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行并完成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

2.試劑和儀器：DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-ME培養(yǎng)基、減血清培養(yǎng)基和Lipofectamine 3000試劑(Gbico公司，美國(guó))；Trizon試劑(總RNA提取)、超純RNA提取試劑盒(ultrapure RNA)、HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒和UltraSYBR Mixture(康為世紀(jì)公司，中國(guó))；蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)不含酚紅(Invitrogen公司，美國(guó))；熒光聚合酶鏈反應(yīng)儀(上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，中國(guó))；低溫高速離心機(jī)(常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司，中國(guó))；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀(杭州艾森生物有限公司，中國(guó))；細(xì)胞周期染色試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó))；旋渦混合器(常州越新儀器制造有限公司，中國(guó))；單道可調(diào)移液器(上海寶予德科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))；CO2培養(yǎng)箱(上海皓莊儀器有限公司，中國(guó))；三目倒置顯微鏡(上海領(lǐng)成生物科技有限公司，中國(guó))。

二、方法

1.髓核細(xì)胞的獲取、鑒定和分組：9只兔經(jīng)耳緣靜脈注射空氣處死，于70%乙醇溶液中浸泡3 min。沿兔背部脊柱正中線剪開(kāi)皮膚，分離并剝開(kāi)椎旁肌，取出脊柱。仔細(xì)剝離椎體周圍所附著的肌肉及軟組織，以尖刀輕輕切開(kāi)纖維環(huán)，暴露髓核組織。以眼科鑷小心夾取膠凍樣髓核組織，以眼科鑷及組織剪去除殘留的纖維環(huán)和終板，將髓核組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊。將剪碎的髓核組織置入0.1%Ⅱ型膠原酶液中37 ℃消化15～20 min，期間用吸管輕輕吹打，待大部分組織被消化、培養(yǎng)液渾濁后，用100目不銹鋼網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾。懸液1 000 r/min，離心8 min，混懸計(jì)數(shù)細(xì)胞，以(1×105)/ml接種到6孔培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿中。生長(zhǎng)培養(yǎng)液為DMEM/F-12，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。第6天進(jìn)行第1次換液，以后每隔3 d換液1次，記錄融合至90%的時(shí)間。待細(xì)胞融合至90%后以0.25%胰蛋白酶液消化并傳代。髓核細(xì)胞爬片后行HE染色和甲苯胺藍(lán)染色鑒定。將生長(zhǎng)良好的髓核細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。將所獲得的每只兔髓核細(xì)胞分為5組進(jìn)行培養(yǎng)：對(duì)照組(常氧濃度下培養(yǎng)6 h)、低氧6 h組(2% O2濃度下培養(yǎng)6 h)、低氧12 h組(2% O2濃度下培養(yǎng)12 h)、低氧24 h組(2% O2濃度下培養(yǎng)24 h)和低氧48 h組(2% O2濃度下培養(yǎng)48 h)。

2.各組髓核細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：取生長(zhǎng)良好的兔髓核細(xì)胞，以1 ml 磷酸鹽緩沖液沖洗每個(gè)孔2次，并置入200 μl含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰蛋白酶液中進(jìn)行消化，制備細(xì)胞懸液。將所得細(xì)胞懸液以2 500 r/min 離心3 min，棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液1 ml，以2 500 r/min再次離心3 min，棄上清液。每管各加入磷酸鹽緩沖液300 μl，混勻。每管各加入Annexin V-FITC 雙標(biāo)記試劑5 μl 和 胰蛋白酶抑制劑5μl，輕微混勻，室溫下避光孵育10 min后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀上，通過(guò)FITC通道檢測(cè)Annexin V-FITC雙標(biāo)記髓核細(xì)胞(Ex=488 nm；Em=530 nm)，通過(guò)PE通道檢測(cè)胰蛋白酶抑制劑。

3.各組髓核細(xì)胞中HIF-1α、ASIC3及AQP3 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)法(real-time PCR,RT-PCR)。以Trizol法提取各組細(xì)胞中總RNA。取總 RNA 1μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以 GAPDH 為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物：HIF-1α上游為5'-TTTGATTTTACCCATCCGTG-3'，下游為5'-CTTCCAGGTGGCAGACTTTA-3'；ASIC3 上游為5'-GAGCAGAAGAAGGCTTACGAA-3'，下游為5'-TAGAGGCGAGTGACGAGGT-3'；AQP3上游為5'-TGGCTACGCTGTCAACCCT-3'，下游為5'-ACGAAGACGCCCGCAAT-3'。對(duì)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 1 μl 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后進(jìn)行產(chǎn)物溶解曲線分析以判斷反應(yīng)的特異性，并通過(guò)2-ΔΔCt 得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

一、兔髓核細(xì)胞的鑒定

兔髓核細(xì)胞HE染色效果良好，組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)核糖體呈紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分呈紅色(圖1，2)。甲苯胺藍(lán)染色效果良好，組織結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細(xì)胞呈深藍(lán)色(圖3，4)。

圖1 顯微鏡下見(jiàn)兔髓核細(xì)胞(HE，×40)

圖2 顯微鏡下見(jiàn)兔髓核細(xì)胞(HE，×100)

圖3 顯微鏡下見(jiàn)兔髓核細(xì)胞(甲苯胺藍(lán)，×40) 圖4 顯微鏡下見(jiàn)兔髓核細(xì)胞(甲苯胺藍(lán)，×100)

二、各組兔髓核細(xì)胞凋亡率的比較

與對(duì)照組比較，低氧各組髓核細(xì)胞凋亡率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；與低氧12、24和48 h組比較，低氧6 h組細(xì)胞凋亡率最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組兔髓核細(xì)胞凋亡率比較 A 對(duì)照組 B 低氧6 h組 C 低氧12 h組 D 低氧24 h組 E 低氧48 h組

三、各組兔髓核細(xì)胞HIF-1α、ASIC3 和AQP3 mRNA表達(dá)水平的比較

與對(duì)照組比較，低氧各組HIF-1α、ASIC3 mRNA表達(dá)水平均明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；與低氧12、24和48 h組比較，低氧6 h組HIF-1α、ASIC3 mRNA表達(dá)水平最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與對(duì)照組比較，低氧各組AQP3 mRNA表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組兔髓核細(xì)胞HIF-1α、ASIC3 和AQP3 mRNA表達(dá)水平的比較

討 論

腰椎間盤突出組織自發(fā)性吸收是指腰椎間盤突出組織未經(jīng)消融或手術(shù)治療等措施自發(fā)縮小甚至完全吸收的現(xiàn)象。關(guān)于其機(jī)制目前尚不明了，得到相對(duì)公認(rèn)的機(jī)制包括炎性細(xì)胞的吞噬作用、突出組織血管化、免疫反應(yīng)、金屬基質(zhì)蛋白酶和組織金屬蛋白酶抑制劑的作用等[8-10]。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞凋亡也可能在其中起重要作用[11]。然而，是否存在一個(gè)可以促進(jìn)腰椎盤突出組織自發(fā)性吸收進(jìn)程的微環(huán)境？目前仍未知。本研究在不同時(shí)效的低氧環(huán)境下培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡情況，檢測(cè)細(xì)胞HIF-1α、ASIC3和AQP3 mRNA表達(dá)水平，從而探討缺氧環(huán)境對(duì)腰椎間盤突出組織自發(fā)性吸收的影響及其可能的作用機(jī)制。

椎間盤的微環(huán)境以低氧為特征，椎間盤細(xì)胞通過(guò)限制氧的消耗來(lái)適應(yīng)局部缺氧環(huán)境。其中HIF-1α是缺氧時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝和存活能力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]。Ha等[13]發(fā)現(xiàn)破裂的椎間盤組織中HIF-1α的含量較未破裂椎間盤組織顯著升高，認(rèn)為HIF-1α在椎間盤自發(fā)性吸收中起重要作用。但是截至目前為止，對(duì)HIF-1α與細(xì)胞凋亡間的關(guān)系仍未完全闡明。Zeng等[14]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α可誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞半乳糖凝集素-3的表達(dá)，從而抑制由凋亡相關(guān)因子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)程，因此認(rèn)為HIF-1α可能有抑制髓核細(xì)胞凋亡的作用。但也有學(xué)者提出與之相反的觀點(diǎn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重缺氧及高表達(dá)的HIF-1α可能促使髓核細(xì)胞凋亡，認(rèn)為通過(guò)HIF-1α的高表達(dá)來(lái)促使部分細(xì)胞凋亡有助于在不利環(huán)境下維持椎間盤的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[11-15]。本研究在不同時(shí)效低氧環(huán)境下培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞，與對(duì)照組相比其凋亡率均明顯升高，表明低氧環(huán)境下可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且以低氧培養(yǎng)6 h時(shí)細(xì)胞凋亡最為明顯。此時(shí)伴隨的HIF-1α mRNA高表達(dá)，可能與低氧環(huán)境下細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，在后續(xù)研究中可通過(guò)加入其特異性阻斷劑來(lái)進(jìn)一步揭示其內(nèi)在聯(lián)系。

髓核為無(wú)血管的組織，被包裹在纖維環(huán)內(nèi)，可被認(rèn)為是一個(gè)特異性抗原。隨著纖維環(huán)撕裂，髓核組織突出，將導(dǎo)致機(jī)體自身免疫反應(yīng)，從而引起一系列炎性反應(yīng)。組織學(xué)研究結(jié)果顯示突出的髓核組織內(nèi)有大量新生血管長(zhǎng)入，存在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[16-18]，從而促進(jìn)了椎間盤自發(fā)性吸收的進(jìn)程。因此炎癥水平的高低與突出的髓核組織自發(fā)性吸收密切相關(guān)。有研究結(jié)果表明，激活A(yù)SIC3可促進(jìn)多種炎性因子如TNF-α和IL-6的表達(dá)[19]，同時(shí)HIF-1α與缺氧狀態(tài)下機(jī)體眾多炎性因子表達(dá)、免疫反應(yīng)的各種應(yīng)答機(jī)制密切相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧各組細(xì)胞ASIC3 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，以低氧6 h組最為顯著，同時(shí)ASIC3 mRNA表達(dá)水平與HIF-1α mRNA表達(dá)水平呈同步狀態(tài)。ASIC3和HIF-1α mRNA表達(dá)水平上調(diào)使局部炎性反應(yīng)加強(qiáng)，通過(guò)炎性細(xì)胞的吞噬作用促進(jìn)突出髓核組織自發(fā)性吸收。HIF-1α和ASIC3之間是否存在協(xié)同促進(jìn)作用有待進(jìn)一步研究。

AQP 是一種膜主體內(nèi)在蛋白，可以介導(dǎo)自由水分子的跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。在形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)之一是水流失和體積縮小。高勵(lì)斌等[22]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制AQP3的表達(dá)可降低細(xì)胞自噬水平從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下髓核細(xì)胞AQP3 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降，與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)反饋關(guān)系，提示AQP3可能也參與了髓核細(xì)胞凋亡的過(guò)程，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，短時(shí)間的低氧環(huán)境可以促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與HIF-1α和ASIC3 mRNA表達(dá)增加及AQP3 mRNA表達(dá)降低有關(guān)。