黃酮類混合物的堿金屬加合離子電噴霧質(zhì)譜研究1

張 娜，崔 朋，劉 偉

（1.黃山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院；2.黃山學(xué)院 現(xiàn)代教育技術(shù)中心，安徽 黃山 245041）

在天然產(chǎn)物的研究中，應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知的活性物質(zhì)具有特別重要的意義.然而，利用現(xiàn)有的分析技術(shù)和方法對這些化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定仍然是一個(gè)挑戰(zhàn).這是由于天然產(chǎn)物中有較多異構(gòu)體的存在，且有些物質(zhì)具有高豐度的碎片離子峰，而分子離子峰的豐度較低、信息貧乏，從而導(dǎo)致未知化合物識別過程中具有不可避免的模糊性.

為了克服上述缺點(diǎn)，學(xué)者們做出了不同的探討.Hadavi Darya［1］以加合離子的形成作為研究10 種異構(gòu)體分子結(jié)構(gòu)的工具，結(jié)果表明飛行時(shí)間（TOF）對鈉和鋰加合物具有最高的分辨率，同時(shí)加合離子的形成有助于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體甚至立體異構(gòu)體在分離時(shí)產(chǎn)生不同的分子構(gòu)象，因此評估加合物和不同構(gòu)象結(jié)構(gòu)是物質(zhì)分離鑒定時(shí)很有價(jià)值的策略.Younes Valadbeigi［2］、Tamar Shamai Yamin［3］也利用質(zhì)譜中伴隨的金屬離子加合物使結(jié)構(gòu)解析更加可靠.趙凡智課題組［4］研究發(fā)現(xiàn)，在糖苷混合物中引入堿金屬離子后，混合物FAB 正離子譜中僅出現(xiàn)加合離子峰而難于找到碎片的加合離子峰，且由于兩種堿金屬離子Na+和Li+原子量之差為16，質(zhì)譜圖中會出現(xiàn)兩個(gè)一組的多組強(qiáng)峰，且每組的兩峰質(zhì)量差為16，其中低質(zhì)量峰為［M+Li］+峰，高質(zhì)量峰為［M+Na］+峰，以此可以判斷各成分的精確質(zhì)量數(shù)，同時(shí)譜圖中出現(xiàn)的強(qiáng)峰組數(shù)就是糖苷混合物的成分?jǐn)?shù).周劍［5］、荀合［6］等人也得出了類似的結(jié)論.

在眾多的研究中，堿金屬離子主要采用Li，Na，K和Cs；基體為巰基尿酸共軛物［1］、胞嘧啶［2］、哌醋酯衍生物［3］、糖苷混合物［4］、疏螺旋體素［5］、丙烯醛脫氧鳥苷［7］、甜菜堿等生物樣品［8］、苯分子［9］、木質(zhì)素［10］、聚己二酸丁二醇酯［11］、聚乙二醇［12］等；廣泛采用的離子源為FAB 及ESI 離子源［4-14］；以ESI 為離子源，黃酮和黃酮苷為基體，采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)研究黃酮類堿金屬加合物則未見報(bào)道.

本文利用UPLC-QTOF-MS 技術(shù)，采用ESI 離子源，在正離子模式下采集數(shù)據(jù)，研究了7種黃酮類混合物（基體B）與堿金屬離子混合物M+（M=Li、Na 和K）的加合質(zhì)譜，探討了基體B 與M+在不同碰撞能、不同濃度、不同加入方式下堿金屬加合離子的形成以及不同加合離子的相對豐度，以期為天然產(chǎn)物中未知物質(zhì)的分離鑒定提供理論依據(jù).

1 試劑與儀器

主要試劑有表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、芹菜素-7-o-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素、煙花苷、芒果苷、野漆樹苷、甲醇、乙腈、無水乙醇，均為HPLC或更高級別；氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀為優(yōu)級純.

主要儀器有超高效液相串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（waters）、超純水機(jī)（Milli-Q）等.

2 實(shí)驗(yàn)條件

2.1 UPLC色譜條件

CORTECS UPLC C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；純水A-乙腈B 流動相；梯度洗脫程序?yàn)?～1 min（90%A，10%B），1～15 min（90%A～10%A，10%B～90% B），15～17 min（10% A～70% A，90% B～30% B），17～17.5 min（70% A～90% A，30% B～10% B），17.5～20 min（90% A，10% B）；柱溫為40.0℃；流速0.300 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL.

2.2 Q-TOF/MS質(zhì)譜條件

使用電噴霧離子源進(jìn)行正離子掃描（ESI+）；掃描范圍m/z 100～1500；掃描時(shí)間0～20 min；錐孔電壓40 V；毛細(xì)管電壓3 kV；使用900 L/h 氮?dú)鉃槌軇怏w；除溶劑溫度為500 ℃；碰撞能量分別采用6 eV 和10～20 eV.

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

黃酮類基體B 混標(biāo)與單標(biāo)均為10μg/mL 甲醇溶液；堿金屬離子M+混合溶液為0.1 mol/L 水溶液，使用時(shí)逐級稀釋.

不同碰撞能：6 eV（模式一，低能量）和10～20 eV（模式二，高能量）；

不同濃度M+：濃度分別為0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L；

M+不同加入方式：流動相中加入M+直接掃描；基體B中加入M+，放置1 h后掃描.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 總離子流圖

圖1 總離子流圖（ESI+，碰撞能10～20eV，M+=5×10-3mol/L）

由圖1可見7種化合物實(shí)現(xiàn)分離，根據(jù)質(zhì)譜圖中的準(zhǔn)分子離子峰，可確定峰1～7 分別為表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、芒果苷、芹菜素-7-o-β-D-吡喃葡萄糖苷、野漆樹苷、煙花苷、異鼠李素.

3.2 不同碰撞能時(shí)化合物的質(zhì)譜圖

以野漆樹苷為例（精確質(zhì)量數(shù)為578.1626），對比模式一和模式二（碰撞能量分別為6 eV 和10～20 eV）下的質(zhì)譜圖，觀察不同堿金屬加合離子的豐度.由圖2可見，不同碰撞能下，m/z 579［M+H］+豐度均為最大，m/z 585［M+Li］+豐度極小，碰撞能增大時(shí)，m/z 601［M+Na］+、m/z 617［M+K］+豐度明顯升高，更適合于觀察堿金屬加合物.同時(shí)，各加合物［B+M］+成組出現(xiàn)，質(zhì)量數(shù)之差為16，可直接確定待測物的精確質(zhì)量數(shù).下文以高能量時(shí)質(zhì)譜圖為例，進(jìn)行豐度對比.

圖2 不同碰撞能下野漆樹苷的質(zhì)譜圖

3.3 不同濃度M+時(shí)化合物的質(zhì)譜圖

以野漆樹苷為例，對比不同濃度M+時(shí)化合物的質(zhì)譜圖（M+=0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L），觀察不同堿金屬加合離子的豐度（見圖3），結(jié)果顯示隨著M+離子濃度的增加，m/z 601［M+Na］+、m/z 617［M+K］+豐度都有所升高，顯示加合物的豐度與M+濃度有關(guān).同時(shí)高碰撞能下m/z 579［M+H］+、m/z 585［M+Li］+豐度極小，推測［B+M］+的豐度不僅與底物的結(jié)構(gòu)和金屬離子濃度有關(guān)，還與金屬離子的直徑大小有關(guān).同時(shí)，加合物［B+M］+仍然成組出現(xiàn).

圖3 不同濃度M+時(shí)野漆樹苷的質(zhì)譜圖

3.4 不同加入方式時(shí)的質(zhì)譜圖

以野漆樹苷為例，對比不同加入方式時(shí)化合物的質(zhì)譜圖（加入基體B中放置1h、加入流動相），觀察不同堿金屬加合離子的豐度（見圖4），結(jié)果顯示直接加入流動相時(shí)，加合物的豐度相對較高，加合物［B+M］+也成組出現(xiàn).

圖4 不同加入方式時(shí)野漆樹苷的質(zhì)譜圖

3.5 不同實(shí)驗(yàn)條件下，堿金屬加合離子的豐度對比

以相同的方法研究了除野漆樹苷外的其他6種黃酮類化合物，探討了不同碰撞能（6 eV、10～20 eV）；不同濃度M+（0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L）；M+不同加入方式（加入流動相中、加入基體B 中并放置1h）條件下，加合物［B+M］+的豐度變化，結(jié)果顯示，表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、芹菜素-7-o-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素、煙花苷、芒果苷6 種黃酮類化合物與野漆樹苷具有相同的規(guī)律，不同條件下各加合物［B+M］+的豐度見表1-3.

由表1 可見，隨著碰撞能的增加，［M+H］+的相對強(qiáng)度通常會減弱，加合物［B+M］+的相對強(qiáng)度有所增強(qiáng)；異鼠李素在不同碰撞能條件下，［M+H］+的相對豐度均為最高，從結(jié)構(gòu)上看，與文中其他6種黃酮類物質(zhì)相比，其結(jié)構(gòu)中含有的羥基最少，推測是由于羥基最少且不含糖苷，因此相對來說難以形成［B+M］+加合物.

表1 不同碰撞能時(shí)，加合物［B+M］+的相對強(qiáng)度（M+=5×10-2mol/L）

（續(xù)表1）

由表2 可見，隨著M+濃度的增加，［M+Li］+、［M+K］+的相對強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；［M+H］+、［M+Na］+的相對強(qiáng)度則無此規(guī)律，這或許是由于受環(huán)境或流動相中H+、Na+影響的緣故.

表2 不同濃度M+時(shí)，加合物［B+M］+的相對強(qiáng)度（M+=0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L，10～20eV）

由表3 可見，通常情況下，將M+加入流動相中，可以獲得更高的［B+M］+豐度.同時(shí)可以看出，低碰撞能和低的M+濃度下，［M+H］+相對豐度通常較高，這對加合物［B+M］+的研究是不利的，提示在進(jìn)行［B+M］+研究時(shí)應(yīng)采用高碰撞能和高的M+濃度.

表3 不同加入方式時(shí)，加合物［B+M］+的相對強(qiáng)度（加入基體B中放置1h、加入流動相中，M+=5×10-3mol/L，6eV）

4 結(jié)論

如上所述，在基體中加入適量的堿金屬離子形成加合離子可以作為確定未知物精確質(zhì)量數(shù)和結(jié)構(gòu)鑒定的常用方法.研究結(jié)果顯示：在流動相中加入高濃度的M+離子，采用高的碰撞能掃描模式，可以在質(zhì)譜中看到更多的、豐度更高的堿金屬加合離子.由于堿金屬加合離子之間的差值均為16，同一物質(zhì)能觀察到幾對加合離子峰，故可以較容易的判斷出準(zhǔn)分子離子，從而為復(fù)雜混合物的分析鑒定提供參考.需要注意的是，不同化合物加合離子的形成具有選擇性，對Li+、Na+和K+表現(xiàn)出不同的加合能力，這仍需要進(jìn)行深入的研究.