梅毒免疫印跡法在梅毒血清固定患者診斷中的臨床應(yīng)用

王欣俞，趙晉文，焦曼玉，張鈺旗，王鑫琪，劉紫旺，劉千赫，楊微，劉緣，張春紅，張海關(guān)，張凱，王琳，王立強(qiáng)

(河北燕達(dá)醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.皮膚科，c.老年病科，d.健康體檢科，河北 廊坊 065201)

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponempallidum,Tp)感染引起的一種慢性多階段發(fā)展的性傳播疾病，雖然青霉素對Tp治療有效，但梅毒感染仍在世界范圍內(nèi)普遍存在，特別是發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家的男同性戀者梅毒感染率急劇增加。隨著梅毒發(fā)病率的升高，梅毒血清固定確診的概率也隨之上升。目前尚無疫苗進(jìn)行特異性預(yù)防，早期診斷對梅毒防控意義重大，影響成人與新生兒身心健康[1-3]。梅毒實(shí)驗(yàn)室檢查包括直接病原體檢查、血清學(xué)試驗(yàn)和核酸擴(kuò)增試驗(yàn)。臨床梅毒篩查和診斷常用血清學(xué)試驗(yàn)，包括非Tp血清學(xué)試驗(yàn)和Tp血清學(xué)試驗(yàn)[4]。隨著基因工程技術(shù)和Tp全基因測序的快速發(fā)展，以TpN47、TpN17、TpN15和TpN45為包膜抗原的血清學(xué)試驗(yàn)具有高靈敏度和特異度[5-6]。重組診斷抗原的檢測方法極大促進(jìn)了特異、快速、精準(zhǔn)的梅毒血清學(xué)診斷。蛋白印跡法為國際公認(rèn)的梅毒確診方法[7]，通過大腸埃希菌表達(dá)的重組蛋白作為診斷抗原，測定特異性Tp抗體[8]。本研究主要探討梅毒螺旋體免疫印跡法(Treponemapallidum-western blot，TP-WB)在梅毒血清固定患者診斷中的臨床應(yīng)用，評估梅毒血清固定患者的診斷及治療。

1 資料與方法

1.1一般資料 使用美國雅培i2000化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析儀對2017年6月至2020年1月河北燕達(dá)醫(yī)院收治的57 612例患者進(jìn)行梅毒血清學(xué)篩查，選取36例梅毒篩查化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法(chemiluminescence microparticle immunoassays，CMIA)相對發(fā)光單位(relative light unit,RLU)/cut-off RLU(S/CO)值≥1的梅毒血清固定患者作為血清固定組，30例S/CO值<1的患者作為對照組。血清固定組納入標(biāo)準(zhǔn)：梅毒經(jīng)過正規(guī)驅(qū)梅治療；排除重復(fù)感染和可能引起非Tp抗原反應(yīng)素試驗(yàn)假陽性的因素及神經(jīng)梅毒；非Tp抗原素試驗(yàn)長期維持在低滴度不陰轉(zhuǎn)[9]。本研究獲得河北燕達(dá)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 采用Tp抗原試驗(yàn)CMIA和快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(rapid plasma reagin circle card test，RPR)法對血清固定組和對照組樣本進(jìn)行檢測，以TP-WB法(金標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行確證；并根據(jù)RPR法基線滴度對血清固定患者進(jìn)行分組，其中O組為原倍陽性(1∶1)，A組、B組、C組、D組分別滴度為1∶2、1∶4、1∶8和1∶16稀釋。

CMIA法為Tp抗原試驗(yàn)檢測Tp特異性抗體，采用CMIA試劑盒(美國雅培公司生產(chǎn)，批號：08519BE01)說明書結(jié)果判讀，S/CO值≥1認(rèn)定為反應(yīng)性，S/CO值<1認(rèn)為非反應(yīng)性。隨后采用RPR法(RPR試劑盒，上?？迫A公司生產(chǎn)，批號：20170904)監(jiān)測病程。采用TP-WB法(TP-WB法試劑盒,德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷公司生產(chǎn)，批號：D191028AC)進(jìn)行梅毒血清學(xué)確證,依據(jù)EUROLineScan軟件判讀抗原帶著色的深淺，結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：抗原帶著色強(qiáng)度0～13為陰性，14～23為灰區(qū)，≥24為陽性，儀器判讀檢測線性為0～255。至少兩條特異性抗原帶著色強(qiáng)度≥24為陽性；一條特異性抗原帶著色強(qiáng)度≥24為可疑陽性[4]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將檢測的原始數(shù)據(jù)保存為CSV格式的數(shù)據(jù)矩陣，格式參照通用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析平臺MetaboAnalyst 4.0(https://www.metaboanalyst.ca)要求。數(shù)據(jù)上傳后不經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換或歸一化，采用平臺的統(tǒng)計(jì)分析模塊進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)可視化，具體步驟如下：相關(guān)性分析采用Pearsonr距離法；采用One-way ANOVA & post-hoc Tests進(jìn)行組間差異比較，其中Post-hoc analysis采用Fisher′s LSD；采用主成分分析Biplot對不同指標(biāo)的影響因子及相關(guān)關(guān)系進(jìn)行可視化；采用偏最小二乘判別分析的變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)方法對不同分組關(guān)鍵因素進(jìn)行可視化，并計(jì)算VIP值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1血清固定組和對照組血清學(xué)檢測結(jié)果 血清固定組中CMIA法及RPR法均為陽性，TP-WB檢測中TpN15抗體32例反應(yīng)性，TpN17抗體30例反應(yīng)性，TpN45抗體35例反應(yīng)性，TpN47抗體26例反應(yīng)性，根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)顯示，血清固定組中36例均為陽性(表1)。對照組中CMIA法S/CO值<1，結(jié)果判讀均陰性；RPR滴度法顯示，1∶2陽性1例，陰性29例；TP-WB中TpN15及TpN47反應(yīng)性各1例(備注著色強(qiáng)度分別為14和17，結(jié)果判讀為陰性)，即對照組30例均為陰性(表1)。梅毒血清固定組代表性樣本TP-WB方法檢測結(jié)果見圖1，著色反應(yīng)條帶中從左至右依次為TpN15、TpN17、TpN45、TpN47，其中TpN47顯色強(qiáng)度最低，TpN15、TpN17、TpN45對應(yīng)的條帶著色強(qiáng)度較高，且不同程度展寬。

表1 血清固定組和對照組RPR滴度分布及TP-WB抗體表達(dá)的比較 (例)

2.2血清固定患者RPR基線滴度中EUROLineScan軟件判讀TP-WB抗體著色強(qiáng)度及5組VIP分析結(jié)果 血清固定患者RPR基線滴度中EUROLineScan軟件判讀TP-WB抗體著色強(qiáng)度，O組(n=13)、A組(n=6)、B組(n=5)、C組(n=6)、D組(n=6)不同基線滴度樣本TpN15、TpN17、TpN45和TpN47的色帶著色強(qiáng)度不同。其中TpN15讀數(shù)范圍為6～129，TpN17讀數(shù)范圍為0～119，TpN45讀數(shù)范圍為7～109，TpN47讀數(shù)范圍為0～58，CMIA讀數(shù)范圍為3～24，樣本讀數(shù)分布見圖2a。血清固定患者RPR法基線滴度分組中TP-WB四種抗體表達(dá)水平的VIP分析結(jié)果顯示，TpN15、TpN17、TpN45、TpN47及CMIA值的VIP得分分別為1.34、1.18、0.99、0.90、0.03，見圖2b。

Tp：梅毒螺旋體；TP-WB：梅毒螺旋體免疫印跡法

2.3基于RPR滴度分組的TpN15、TpN17、TpN45、TpN47及CMIA差異分析 采用一元方差分析對不同分組中的讀數(shù)進(jìn)行差異比較，結(jié)果見圖3a，其中差異顯著的因子為TpN15，不同分組差異顯著性比較見圖3b。TpN15抗體表達(dá)水平由高到低依次為B組>C組>A組>O組>D組，其中B組顯著高于D組(t=4.137，P=0.008)。

Tp：梅毒螺旋體；CMIA:化學(xué)發(fā)光法；Compounds:因子；RPR value：RPR滴度值；A組、B組、C組、D組、O組為基于RPR法基線滴度的血清固定患者分組

2.4相關(guān)性分析結(jié)果 TP-WB法TpN15、TpN17、TpN45、TpN47抗原條帶讀數(shù)與CMIA讀數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.510，P=0.001；r=0.540，P=0.001；r=0.600，P<0.001；r=0.410，P=0.010)(圖4a)，各因子之間夾角均為銳角，Biplot分析結(jié)果見圖4b；根據(jù)箭頭長度各讀數(shù)的影響大小依次為TpN15>TpN17>TpN45>TpN47>CMIA。

3 討 論

梅毒血清固定是指梅毒患者經(jīng)過規(guī)范的抗梅毒治療和一定時(shí)間隨訪非Tp血清RPR試驗(yàn)維持在一定滴度,主要與性別、年齡、感染階段、RPR基線滴度、無癥狀神經(jīng)梅毒、吉海反應(yīng)、Tp亞型14i/a、細(xì)胞免疫功能狀態(tài)相關(guān)。有研究顯示，女性、潛伏梅毒、非青霉素治療與血清固定呈正相關(guān)[10-11]。研究報(bào)道,有35.2%～44.4%的梅毒患者會發(fā)生血清固定，有35%的血清固定患者可能重新發(fā)展成顯性梅毒[12-13]，這些顯性梅毒患者可發(fā)生神經(jīng)或心血管梅毒以及胎兒宮內(nèi)感染等，其復(fù)發(fā)和持續(xù)存在臨床不容忽視。梅毒復(fù)發(fā)分為血清復(fù)發(fā)和臨床復(fù)發(fā)兩種，以血清復(fù)發(fā)多見[14]。美國疾病預(yù)防控制中心將血清復(fù)發(fā)定義為梅毒治療后6個(gè)月非Tp抗體滴度與治療時(shí)的基礎(chǔ)滴度或最高滴度相比升高4倍[10]。在Tp致病過程中位于細(xì)胞內(nèi)膜層的膜脂蛋白是Tp重要的毒力因子，參與宿主黏附、定植、播散以及激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，對宿主的固有免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的調(diào)控作用[15-17]。TpN15功能仍不明確；TpN17為β桶狀蛋白[18]，在維持膜結(jié)構(gòu)、通過激活內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)黏附分子和趨化因子等方面起重要作用[19]；TpN47是一種羧肽酶，能促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成細(xì)胞間黏附分子-1以及誘導(dǎo)血管間黏附分子[20]。TP-WB法包被重組抗原TpN15、TpN17、TpN47以及TpN45，與Tp引起的梅毒免疫反應(yīng)密切相關(guān)，靈敏度和特異度高[21]。

Tp：梅毒螺旋體；CMIA:化學(xué)發(fā)光法

本研究基于RPR法基線滴度值對梅毒血清固定樣本進(jìn)行了分組，同時(shí)采用TP-WB法和CMIA法對樣本進(jìn)行檢測，對不同方法讀數(shù)進(jìn)行分析和比較。結(jié)果顯示,不同樣本TpN15、TpN17、TpN45和TpN47的色帶著色強(qiáng)度不同，TP-WB法各抗原條帶讀數(shù)與CMIA讀數(shù)均呈正相關(guān)，不同抗原反應(yīng)與RPR基線滴度相關(guān)。對照組中1例血清特異性抗體CMIA法檢測結(jié)果陰性，RPR法檢測結(jié)果滴度為1∶2，其非特異性抗體存在假陽性反應(yīng)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，人類免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、免疫接種、妊娠、注射吸毒和老年人中可能出現(xiàn)非特異性抗體試驗(yàn)假陽性結(jié)果[22]。梅毒血清固定可能是機(jī)體的一種特定免疫狀態(tài)，而與Tp的持續(xù)存在無關(guān)[23]。TP-WB中抗體表達(dá)提示梅毒血清固定患者免疫狀態(tài)。

綜上所述，在梅毒血清固定患者中TP-WB不同抗體與RPR基線滴度相關(guān)，TP-WB中抗體表達(dá)具有重要的診斷價(jià)值，CMIA法、RPR與TP-WB法聯(lián)合檢測有利于提高梅毒血清固定診斷價(jià)值。但本研究也存在不足之處，由于臨床梅毒血清固定患者樣本量少，研究對象的變化程度不一，研究結(jié)果存在一定的局限性。未來應(yīng)聯(lián)合多中心、大樣本的臨床研究設(shè)計(jì)，建立數(shù)據(jù)庫，為梅毒實(shí)驗(yàn)診斷以及抗梅毒血清固定患者治療提供新思路。