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    沉默AQP3基因表達對結直腸癌細胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響

    2021-01-05 14:17鄭斯鑫周春華孔文成尹光
    中國現代醫(yī)生 2021年31期
    關鍵詞:增殖凋亡結直腸癌

    鄭斯鑫 周春華 孔文成 尹光

    [摘要] 目的 探討沉默水通道蛋白3(AQP3)基因表達對結直腸癌細胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響。 方法 體外培養(yǎng)結直腸癌細胞LoVo,采用梯度濃度誘導法建立紫杉醇耐藥細胞株LoVo/Taxol。將LoVo細胞和LoVo/Taxol細胞分別分為空白對照組(細胞不做任何特殊處理)、陰性對照組(轉染陰性對照質粒)、shAQP3組(沉默AQP3表達),逆轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)和Western blot法檢測AQP3 mRNA和蛋白表達。CCK-8實驗檢測細胞的增殖能力,流式細胞術檢測細胞的凋亡情況。四唑化合物(MTS)檢測紫杉醇的細胞毒性。結果 人結腸癌細胞LoVo中AQP3 mRNA相對表達量和蛋白表達量均高于人正常結腸上皮細胞NCM460和HCoEpiC,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。敲低AQP3表達后,shAQP3組LoVo細胞增殖活性(OD值)較空白對照組和陰性對照組降低,同時凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。成功構建LoVo/Taxol耐藥細胞,對紫杉醇、5-Fu、阿霉素的耐藥指數分別為(31.97±1.78)、(17.97±2.14)、(104.80±5.53)。而shAQP3組LoVo/Taxol細胞對紫杉醇、5-Fu、阿霉素的耐藥指數分別為(6.06±0.25)、(5.57±0.20)、(21.23±0.27),較空白對照組和陰性對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論 沉默AQP3基因表達能夠抑制結直腸癌細胞增殖,促進結直腸癌細胞凋亡并增強LoVo/Taxol耐藥細胞的化療敏感性。

    [關鍵詞] AQP3;結直腸癌;增殖;凋亡;化療敏感性

    [中圖分類號] R735.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701(2021)31-0006-06

    [Abstract] Objective To explore the effect of silencing aquaporin 3 (AQP3) gene expression on the proliferation, apoptosis, and chemosensitivity of colorectal cancer cells. Methods LoVo colorectal cancer cells were cultured in vitro, and the LoVo/Taxol paclitaxel-resistant cell lines were established by gradient concentration induction method. The LoVo cells and LoVo/Taxol cells were divided into the blank control group (no special treatment), the negative control group (negative control plasmid transfection), and the shAQP3 group (silencing AQP3 expression). Reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot method were used to detect AQP3 mRNA and protein expression. CCK-8 experiment was used to detect cell proliferation ability, and flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Tetrazolium compound (MTS) was used to detect the cytotoxicity of paclitaxel. Results The AQP3 mRNA relative expression and protein expression in human colon cancer cells LoVo were higher than those in human normal colonic epithelial cells NCM460 and HCoEpiC,the difference was statistically significant (P<0.05). After knocking down the AQP3 expression, the proliferation activity (OD value) of LoVo cells in the shAQP3 group was lower than those in the blank control group and the negative control group, and the apoptosis rate was higher than those in the blank control group and the negative control group,the difference was statistically significant(P<0.05). The LoVo/Taxol resistant cells were successfully constructed, and the resistance indexes to paclitaxel, 5-Fu and adriamycin were (31.97±1.78), (17.97±2.14), (104.80±5.53), respectively. The resistance indexes of LoVo/Taxol cells to paclitaxel, 5-Fu and adriamycin in the shAQP3 group were (6.06±0.25), (5.57±0.20), (21.23±0.27), respectively, which were significantly lower than those in the blank control group and the negative control group,the difference was statistically significant(P<0.05). Conclusion Silencing AQP3 gene expression can inhibit the proliferation of colorectal cancer cells, promote the apoptosis of colorectal cancer cells, and enhance the chemosensitivity of LoVo/Taxol resistant cells.

    [Key words] AQP3; Colorectal cancer; Proliferation; Apoptosis; Chemosensitivity

    2018年,中國結直腸癌發(fā)病率占世界的24.3%,病死率占世界的22.9%,且逐漸呈現年輕化趨勢[1]。為了提高臨床治療效果,有必要更好地了解結直腸癌的發(fā)生機制,從而推動精準醫(yī)學的發(fā)展。水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是一種糖基化的膜整合蛋白,能夠通過跨質膜的滲透梯度促進跨上皮水分子轉運[2]。雖然AQPs存在于多種組織中,但大多具有獨特的組織表達模式,如在某些腫瘤細胞中表達非?;钴S。研究表明,AQP3在多種腫瘤細胞增殖、生存、轉移中起著關鍵作用[3]。Hong等[4]研究也發(fā)現血清AQP-1、AQP-3對年輕結腸癌患者具有重要的預后價值,但是缺乏基礎實驗證據支持。因此,本研究分別以結直腸癌親本細胞LoVo和紫杉醇耐藥細胞株LoVo/Taxol作為研究對象,探討沉默AQP3基因表達對結直腸癌細胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響,以期為尋找結腸癌新的靶點提供證據。

    1 材料與方法

    1.1 細胞來源及培養(yǎng)

    人結腸癌細胞系SW620、LoVo、HCT116、SW480、Caco-2、HT-29及人正常結腸上皮細胞NCM460、HCoEpiC,均購自中國科學院(上海)典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)液中,輔以10%胎牛血清、50 IU/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺,培養(yǎng)在37℃、5%CO2生化培養(yǎng)箱中。

    1.2 材料

    Dulbecco改良Eagle高糖培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Sigma公司;兔抗人單克隆抗體Anti-AQP3購自美國Cell Signing公司。紫杉醇(Paclitaxel)購自上海Sigma-Aldrich公司,溶解在二甲基亞砜(DMSO)中,制備20 mmol/L儲備液,DMSO終濃度<0.1%(V/V),保存在-80℃,使用前用細胞培養(yǎng)基稀釋。5-Fu購自上海Sigma-Aldrich公司,以20 mmol/L濃度儲存在DMSO中。阿霉素購自上海Sigma-Aldrich公司,用PBS溶解至1 mmol/L保存在 -20℃。AQP3 shRNA轉染質粒購自美國Origene公司;Genjet轉染試劑購自美國SignaGen Laboratories;反轉錄試劑盒與SYBR Premix Ex Taq 試劑盒購自日本TaKaRa公司;CCK-8、MTS試劑盒購自南京建成生物工程研究所;倒置顯微鏡購自日本Olympus公司;Annexin V-FITC/PI 流式細胞檢測試劑盒購自上海朗智生物科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 建立耐藥細胞株? 采用體外梯度濃度誘導法建立LoVo紫杉醇耐藥細胞株,起始濃度為0.05 μmol/L,培養(yǎng)48 h后更換為不含藥物的RPMI-1640完全培養(yǎng)液,待細胞狀態(tài)逐漸正常(約2周)后,以濃度倍增的方式提高藥物濃度,待細胞能夠在1.5 μmol/L紫杉醇溶液中長期穩(wěn)定生長時,制備細胞爬片,用2% Giemsa染液染色,并用安裝了MacBiophotonics插件的Image J(v. 1.39)系統(tǒng)分析細胞和核周長等形態(tài)學參數。收集細胞,用紫杉醇、5-Fu、順鉑驗證細胞的耐藥指數和半數抑制濃度(50% Concentration inhibition,IC50)[5]。

    1.3.2 細胞轉染與分組? 將LoVo和LoVo/Taxol細胞分別分為空白對照組(細胞不做任何特殊處理)、陰性對照組(轉染陰性對照質粒)、shAQP3組(轉染AQP3 shRNA質粒序列)。在4個AQP3 shRNA轉染質粒序列中,選擇下調最明顯的質粒作為穩(wěn)定表達細胞(shAQP3組)的載體用作后續(xù)實驗。用Genjet體外轉染試劑將AQP3 shRNA轉染質粒和對照shRNA質粒[包括一個紅色熒光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)序列和位于SV40啟動子下游的嘌呤霉素-N-乙?;D移酶基因]轉染LoVo細胞。用2 μg/mL嘌呤霉素處理細胞2周后,用玻璃菌落篩選柱挑選抗嘌呤霉素細胞集落。然后對細胞進行5倍的連續(xù)稀釋,最后一次稀釋評估RFP表達和傳代培養(yǎng)。

    1.3.3 qRT-PCR檢測AQP3 mRNA的表達? Trizol試劑盒按照說明書提取總RNA,紫外分光光度法定量后,按照逆轉錄試劑盒說明進行操作。AQP3上游引物:5'-GTC ACT CTG GGC ATC CTC AT-3',下游引物:5'-GCC CAA AAA CTA TTC CAG CA-3'。用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行PCR,擴增條件為94℃,15 s;55℃,15 s;72℃,20 s;共35個循環(huán)。用2-ΔΔCt法以β-actin為內參計算LoVo和LoVo/Taxol各組細胞中AQP3 mRNA的相對表達量。

    1.3.4 Western blot法檢測細胞AQP3蛋白表達 細胞用RIPA 緩沖液溶解,13 000 RCF離心去除不溶性物質,用Lowry法定量分析裂解產物的蛋白質含量,并在690 nm處進行吸光度測量。取每個樣本約60 μg蛋白經12% SDS-PAGE變性分離。隨后以100 V電轉到PVDF膜上,然后用5%脫脂牛奶加入含0.1% Tween-20(TBST)的1×TBS緩沖液進行封閉。封閉后,在TBST和TBS緩沖液中分別洗滌3次和1次,然后在4℃下與兔抗人AQP3抗體孵育過夜,用山羊抗兔IgG-HRP結合的二級抗體再次孵育。洗膜后暴露于EN-ECL化學發(fā)光系統(tǒng)5 min。然后使用GBOX HR 16成像系統(tǒng)和GeneSys軟件進行可視化處理。以微管蛋白(Tubulin)作為內參。

    1.3.5 CCK-8法檢測細胞增殖? 對數生長期的LoVo細胞接種于96孔板上,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑,37℃孵育2 h后,用酶標儀檢測各孔吸光度(OD)值。

    1.3.6 流式細胞術檢測細胞凋亡? 培養(yǎng)48 h后收集各組LoVo細胞,先加入300 μL 1×Binding Buffer 懸浮細胞,然后加入5 μL的Annexin V-FITC混勻、避光、室溫孵育15 min。上機前5 min再加入5 μL PI染色,上機前補加200 μL 1×Binding Buffer,用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

    1.3.7 MTS檢測LoVo/Taxol細胞的多藥耐藥性? 取對數生長期的LoVo細胞和LoVo/Taxol細胞,用0.25%胰酶消化,按5000個/100 μL接種于96孔板,次日更換培養(yǎng)基,將紫杉醇、5-Fu、阿霉素分別稀釋至8個梯度濃度,加藥處理48 h后,每孔加入20 μL的MTS試劑,37℃繼續(xù)孵育3 h,用酶標儀讀取每孔的光密度值(OD=490 nm)。設含紫杉醇組為實驗組,0 nM為對照組,細胞存活率=(實驗組OD490-空白組OD490)/(對照組OD490-空白組OD490)×100%。

    1.4 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析,計量資料以均數±標準差(x±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 人結腸癌細胞和正常結腸上皮細胞中AQP3表達差異

    經qRT-PCR法和Western blot法檢測,人結腸癌細胞系(SW620、LoVo、HCT116、SW480、Caco-2、HT-29)中AQP3 mRNA相對表達量和蛋白表達量均高于人正常結腸上皮細胞NCM460和HCoEpiC,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究選擇AQP3表達量相對較高的LoVo細胞用于后續(xù)研究。見圖1。

    2.2 沉默AQP3表達對細胞LoVo細胞增殖和凋亡活性的影響

    2.2.1 AQP3 mRNA的相對表達量? 經qRT-PCR法和Western blot法檢測,與空白對照組和陰性對照組比較,shAQP3組LoVo細胞中AQP3 mRNA相對表達量和蛋白表達量均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2A。

    2.2.2 細胞增殖活性? 經CCK-8法檢測,分別轉染24、48、72、96 h時,shAQP3組LoVo細胞增殖活性(OD值)均低于空白對照組和陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2B。

    2.2.3 細胞凋亡活性? 經FCM法檢測,shAQP3組LoVo細胞凋亡率為(25.84±3.15)%,高于空白對照組的(5.22±0.37)%和陰性對照組的(6.31±0.75)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2C。

    2.3 LoVo/Taxol耐藥細胞驗證

    歷時8個月,利用體外濃度梯度誘導法成功建立LoVo紫杉醇耐藥細胞株LoVo/Taxol。

    2.3.1 形態(tài)學觀察? Giemsa染色和影像學分析顯示,比較LoVo細胞和LoVo/Taxol耐藥細胞的細胞周長和核周長,均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3A。

    2.3.2 AQP3表達差異? qRT-PCR法和Western blot法檢測結果顯示,與LoVo細胞比較,LoVo/Taxol耐藥細胞中AQP3 mRNA相對表達量和蛋白表達量均顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3B。

    2.3.3 LoVo/Taxol細胞多藥耐藥性驗證? 經MTS法檢測,培養(yǎng)48 h時,LoVo/Taxol細胞對紫杉醇、5-Fu、阿霉素的耐藥指數分別為(31.97±1.78)、(17.97±2.14)、(104.80±5.53)。見圖3C。

    2.4 沉默AQP3表達對細胞LoVo/Taxol細胞多藥耐藥的影響

    2.4.1 AQP3 mRNA的相對表達量? 經qRT-PCR法和Western blot法檢測,與空白對照組和陰性對照組比較,shAQP3組LoVo/Taxol細胞中AQP3 mRNA相對表達量和蛋白表達量均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4A。

    2.4.2 化療藥物細胞毒作用? 經MTS法檢測,培養(yǎng)48 h時,shAQP3組LoVo/Taxol細胞對紫杉醇、5-Fu、阿霉素的耐藥指數分別為(6.06±0.25)、(5.57±0.20)、(21.23±0.27),較空白對照組和陰性對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4B。

    3 討論

    據最新流行病學數據顯示,全世界有超過945 000人患結直腸癌,約492 000人病死[6]。結直腸癌發(fā)病率隨著年齡的增長而增加,這不僅造成沉重的醫(yī)療、經濟負擔,也導致相當的社會生產力損失[7]。手術、放療和化療是直腸癌治療的重要組成部分,尤其是化療對于中晚期結直腸癌的治療必不可少[8]。雖然近年來結直腸癌的治療取得了很大進展,但是化療的效率通常受到癌細胞對治療藥物的耐藥性的限制。鑒于此,為治療干預確定新的細胞靶點對于開發(fā)臨床治療藥物至關重要。本研究發(fā)現,敲低LoVo細胞中AQP3的表達可以顯著調節(jié)結腸癌細胞生物學的多個病理進程,包括細胞增殖、凋亡和化療耐藥。先前的證據表明,AQP3與結腸癌患者預后有關,但是缺少體外證據證明AQP3對結腸癌細胞的作用。針對腫瘤細胞的增殖和凋亡研究是非常重要的,因為腫瘤細胞生長活性與疾病預后有著顯著的相關性。結合上述數據,表明通過抑制AQP3的表達可以通過降低細胞增殖活性,同時提高細胞凋亡率,進而功能性地靶向細胞生長,這也更好地解釋了AQP3可能與結腸癌患者的臨床預后相關。

    AQPs家族的膜蛋白通道促進水分在所有細胞膜上的快速運輸,從而維持體內水分的穩(wěn)態(tài)[9]。迄今為止,已經確定了13種人類AQPs[10],它們分為兩個不同的亞組:經典AQPs(AQP1、2、4、5、6和8),它們只負責運輸水分子;水甘油通道蛋白(Aquaglyceroporins)(AQP 3、7、9和10),它們還會額外運輸小的不帶電荷的分子,如甘油和尿素[11]。AQP3在人體內廣泛表達,參與了越來越多的生理和病理過程,包括糖脂代謝、維持皮膚彈性等[12]。動物研究顯示,AQP3-null小鼠被證明具有較低的傷口愈合能力,同時皮膚癌的發(fā)生風險也較低[13]。此外,在肺癌[14]、乳腺癌[15]和前列腺癌[16]中觀察到AQP3的過表達和異位表達,在這些癌癥中,AQP3有助于轉移、增殖和上皮-間質轉化。腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲在腫瘤的發(fā)展過程中起著重要作用。癌細胞的特征是細胞增殖加速,腫瘤的進展通常與異常的細胞增殖、遷移和侵襲有關。AQP定位于遷移細胞的前緣有助于吸收水分,從而引起小的腫脹,通過增加肌動蛋白絲的空間來促進向前移動[17]。在本研究中,通過敲除AQP3在LoVo細胞中的表達可減少細胞的增殖活性,同時誘導細胞凋亡,說明AQP3低表達對于抑制腫瘤細胞的生長具有積極作用。最近有研究顯示,AQP3可介導細胞內H2O2參與EGF誘導的腫瘤細胞信號轉導及其依賴細胞功能的表皮生長因子的表達,而敲除AQP3基因后,免疫缺陷小鼠 A431細胞移植瘤的生長受到明顯抑制[18]。因此,AQP3在EGFR細胞信號傳導過程中作為第二信使發(fā)揮促腫瘤增殖的作用[19],這表明AQP3可能是這些促癌信號通路的關鍵調節(jié)因子。雖然這些不是直接證據,但也間接說明降低AQP3表達導致細胞行為改變的機制。

    此外,不受控制的增殖活性為癌細胞抵抗常規(guī)化療藥物提供了生存優(yōu)勢。以Taxol為基礎的治療是最常見的結腸癌治療方案之一。然而,Taxol治療常常導致化療耐藥的發(fā)展,導致復發(fā)和治療失敗。AQP3是否參與結腸癌的化療耐藥尚不清楚。Gao等[20]研究證明,AQP3和AQP9過表達抑制了黑色素瘤中亞砷酸鹽的治療效果。本研究發(fā)現,AQP3過表達與LoVo/Taxol細胞化療抵抗有關。敲低AQP3表達后,可以顯著增強LoVo/Taxol細胞對Taxol、5-Fu、阿霉素等細胞毒藥物的敏感性。這些結果表明,AQP3介導了LoVo/Taxol細胞的多藥耐藥性,這與AQP3過表達與結腸癌患者預后不良之間的關系一致。

    AQP3有望成為結腸癌治療的一個令人興奮的靶標,首先它是一種膜蛋白,使用傳統(tǒng)的藥學手段相對容易獲得;其次使用AQP3基因敲除小鼠的研究表明,其主要表型后果僅限于導致皮膚干燥和減少傷口愈合,雖然傷口愈合的延遲可能是術后的一個問題,但是仍然可以通過比較簡單的手段來解決。本研究為進一步的工作提供了一個平臺,然而仍然需要更深入的機制研究以證實AQP3作為結腸癌治療靶點的潛力。

    綜上所述,AQP3高表達可能是促進結腸癌細胞生長和化療耐藥的重要分子機制之一;敲低AQP3表達后,LoVo細胞增殖活性降低,同時凋亡率增加,LoVo/Taxol細胞對多種化療藥物的耐藥性也被逆轉。此研究結果為AQP3在結直腸癌中的作用提供了實驗依據和理論基礎,并為結直腸癌的臨床治療提供新的思路。

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    (收稿日期:2021-04-10)

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