美洲大蠊多肽逆轉(zhuǎn)人肝癌HepG2/ADM細(xì)胞多藥耐藥性的作用及機(jī)制研究

李彩琳，呂 鴻，張鴻翰，王彥權(quán)，彭 芳

美洲大蠊多肽逆轉(zhuǎn)人肝癌HepG2/ADM細(xì)胞多藥耐藥性的作用及機(jī)制研究

李彩琳，呂 鴻，張鴻翰，王彥權(quán)，彭 芳*

大理大學(xué)藥學(xué)院，云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000

探討美洲大蠊多肽（PAE2）逆轉(zhuǎn)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM的作用及機(jī)制。噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)HepG2/ADM細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的耐藥性以及PAE2聯(lián)合化療藥物（5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、奧沙利鉑）對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞增殖的影響；激光共聚焦觀察PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞中藥物累積的影響；Western blotting法檢測(cè)PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9）、DNA修復(fù)酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）表達(dá)的影響；qRT-PCR法檢測(cè)PAE2對(duì)多藥耐藥蛋白1（multiple drug resistance 1，MDR1）、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（breast cancer resistant protein，BCRP）和酶介導(dǎo)的多藥耐藥途徑中蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topoisomerase Ⅱ，Top Ⅱ）的mRNA表達(dá)。PAE2抑制HepG2/ADM細(xì)胞增殖，呈時(shí)間和劑量相關(guān)性。PAE2可逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM對(duì)不同化療藥物的耐藥性；PAE2可上調(diào)HepG2/ADM細(xì)胞中阿霉素水平，呈劑量相關(guān)性。PAE2可顯著上調(diào)耐藥細(xì)胞中Bax、cleaved Caspase-9 p37蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平（＜0.01），對(duì)cleaved PARP蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響。PAE2均顯著下調(diào)HepG2/ADM細(xì)胞中、、、mRNA水平（＜0.01）。結(jié)論 PAE2可以通過(guò)減少藥物外排、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、下調(diào)耐藥蛋白表達(dá)等途徑逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞的多藥耐藥性。

美洲大蠊多肽；PAE2；肝癌；多藥耐藥；HepG2/ADM細(xì)胞

肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率位于全球癌癥第3位[1]。臨床治療采用手術(shù)、放化療、生物療法以及多種方法的聯(lián)用。由于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR），從而降低藥物療效，抗肝癌藥物的治療效果無(wú)法顯著提高。近48年來(lái)，多藥耐藥性成為生物學(xué)家重要的攻克目標(biāo)[2-3]。研究表明，細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥相關(guān)蛋白（multi-drug resistance-associated protein，MRP），增加P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）表達(dá)[4]，從而促進(jìn)藥物外排[5-6]。臨床上使用P-gp抑制劑來(lái)減少腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的多藥耐藥性，但由于化療藥物的毒性、藥物相互作用等因素療效并不顯著?；瘜W(xué)藥物逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用機(jī)制單一、效果不佳，因此尋找高效低毒的藥物來(lái)逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的耐藥性尤為重要。

美洲大蠊L. 是蜚蠊科動(dòng)物體積最大的昆蟲(chóng)，美洲大蠊多肽具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、減輕肝損傷、抗腫瘤等多種藥理作用[7-10]。課題組前期研究表明，美洲大蠊粗提物脫脂膏通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞內(nèi)藥物聚集，抑制P-gp、MRP、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等表達(dá)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)、逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞多藥耐藥等作用[11-16]。PAE2是從美洲大蠊中分離得到的具有明確氨基酸系列且效果最優(yōu)的多肽小分子。本研究采用人肝癌細(xì)胞HepG2、多藥耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM，分別從細(xì)胞內(nèi)藥物累積、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、MRP和酶介導(dǎo)的MDR途徑相關(guān)蛋白幾個(gè)方面探討PAE2逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM多藥耐藥性的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人肝癌HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞購(gòu)自齊氏生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

PAE2（白色粉末，批號(hào)P18267，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.071%）由大理大學(xué)藥學(xué)院張成桂博士提供，以DMEM培養(yǎng)基配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；5-氟尿嘧啶（批號(hào)WXBC6532V，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、青霉素鏈霉素混合液（批號(hào)20190909），購(gòu)自Sigma公司；阿霉素（批號(hào)131102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%），購(gòu)自浙江海正藥業(yè)有限公司；長(zhǎng)春新堿（批號(hào)SV8300，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）、索拉非尼（批號(hào)720N021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%），購(gòu)自索萊寶公司科技有限公司；奧沙利鉑（批號(hào)T0164，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.95%），購(gòu)自TargetMol公司；環(huán)磷酰胺（批號(hào)0A355A），購(gòu)自百特國(guó)際有限公司；胎牛血清（FBS，批號(hào)2166446），購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)F909FA0001）、多藥耐藥蛋白1（multiple drugresistance 1，MDR1）、BCRP、蛋白激酶C（proteinkinase C，PKC）、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topoisomerase Ⅱ，Top Ⅱ）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白抗體（批號(hào)ab6721），購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）兔抗多克隆抗體（批號(hào)00071452）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9）兔抗多克隆抗體（批號(hào)000744407）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl 2-associated X，Bax）兔抗多克隆抗體（批號(hào)00073304）、DNA修復(fù)酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）兔抗多克隆抗體（批號(hào)00055579），購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；GAPDH兔抗多克隆抗體（批號(hào)072319191203）、cDNA第一鏈合成試劑盒（批號(hào)050720190702）、BCA蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0010），購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用試劑。

1.3 儀器

3111型CO2培養(yǎng)箱、SN255939型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；BB16UV/BB5060UV型垂直流超凈臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BSA24S型電子分析天平（Sartorius公司）；TS100型倒置光學(xué)顯微鏡（Olymplus公司）；SN255939型酶標(biāo)儀（Thermo公司）；785BR15145型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國(guó)Bio-Rad）；TD3型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞用含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，HepG2/ADM細(xì)胞另加入阿霉素（0.5 μg/L）以維持細(xì)胞的耐藥性，于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2/ADM細(xì)胞，胰酶消化后，以2.5×105個(gè)/mL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。分別加入不同質(zhì)量濃度（0.1、1、10、100、1000、10 000 g/mL）PAE2，孵育48 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% MTT的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入100 μL DMSO，振蕩30 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸光度（）。采用SPSS軟件計(jì)算PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞的5%抑制濃度（5% inhibitory concentration，IC5）、10%抑制濃度（10% inhibitory concentration，IC10）、20%抑制濃度（20% inhibitory concentration，IC20），分別作為逆轉(zhuǎn)多藥耐藥實(shí)驗(yàn)的低、中、高劑量。

2.3 HepG2/ADM細(xì)胞的多藥耐藥性以及PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、PAE2（IC20＝183.19 μg/mL）組。對(duì)照組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，其余2組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2/ADM細(xì)胞，以2.5×105個(gè)/mL接種于96孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為70%。各組加入以DMEM培養(yǎng)基配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的化療藥物，PAE2組另加入PAE2溶液，同時(shí)設(shè)試劑對(duì)照組和細(xì)胞空白對(duì)照組。其中化療藥物質(zhì)量濃度分別為5-氟尿嘧啶（10、20、40、80、160 μg/mL）、阿霉素（0.31、0.63、1.25、2.50、5.00 μg/mL）、環(huán)磷酰胺（40、80、160、320、640 μg/mL）、長(zhǎng)春新堿（5、10、20、40、80 μg/mL）、奧沙利鉑（10、20、40、80、160 μg/mL）。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL DMSO，振蕩30 min，待紫色結(jié)晶完全溶解，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定值，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率、耐藥倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)[17]。

生長(zhǎng)抑制率＝1－(給藥－試劑對(duì)照)/(細(xì)胞空白對(duì)照－試劑對(duì)照)

耐藥倍數(shù)＝耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50

逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝耐藥細(xì)胞IC50/PAE2處理后耐藥細(xì)胞IC50

2.4 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞藥物累積的影響

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、索拉非尼（2.40 μg/mL，以DMEM培養(yǎng)基配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度）組、PAE2低劑量（IC5＝3.21 μg/mL）組、PAE2中劑量（IC10＝22.19 μg/mL）組、PAE2高劑量（IC20＝183.19 μg/mL）組。對(duì)照組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，其余各組取HepG2/ADM細(xì)胞，以8×106個(gè)/mL接種于直徑3 cm、含細(xì)胞爬片的小皿中，培養(yǎng)24 h。除對(duì)照和模型組外，其余組分別加入對(duì)應(yīng)藥物，培養(yǎng)48 h。PBS洗滌，加入含阿霉素（5 μg/mL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h；用冷PBS洗滌3次，每次5 min，加入4%多聚甲醛避光固定30 min；用冷PBS洗滌2次，每次5 min，加入DAPI染色5 min；用冷PBS洗滌3次，每次5 min；用抗熒光淬滅封片劑封片，避光保存，次日于激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。鏡下ADM陽(yáng)性表達(dá)為紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。采用Image J 6.0軟件計(jì)算阿霉素陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值，熒光強(qiáng)度值越大表明藥物含量越高。

2.5 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、索拉非尼（2.40 μg/mL）組、PAE2低劑量（3.21 μg/mL）組、PAE2中劑量（22.19 μg/mL）組、PAE2高劑量（183.19 μg/mL）組。對(duì)照組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，其余各組取HepG2/ADM細(xì)胞，以7.5×105個(gè)/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h。除對(duì)照和模型組外，其余組分別加入對(duì)應(yīng)藥物，培養(yǎng)48 h。以PBS洗滌后加入50 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上孵育30 min，16 100×，離心5 min，收集上清，采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白的質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，以5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入Bcl-2（1∶1500）、Caspase-9（1∶800）、Bax（1∶2000）、PARP（1∶500）、GAPDH（1∶5000）抗體，于4 ℃孵育過(guò)夜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白抗體（1∶500），室溫孵育2 h，于凝膠成像儀顯影。采用Image J 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.6 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞多藥耐藥和酶介導(dǎo)的MDR途徑相關(guān)蛋白mRNA水平的影響

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、索拉非尼（2.40 μg/mL）組、PAE2低劑量（3.21 μg/mL）組、PAE2中劑量（22.19 μg/mL）組、PAE2高劑量（183.19 μg/mL）組。對(duì)照組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，其余各組取HepG2/ADM細(xì)胞，以2.4×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。除對(duì)照和模型組外，其余組分別加入對(duì)應(yīng)藥物，培養(yǎng)48 h。用Trizol試劑提取總RNA，測(cè)定其質(zhì)量濃度和純度；按cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)操作合成cDNA；以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。引物序列：上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；上游引物5’-TATAGCTCAGATCATTGTCACAGTC-3’，下游引物5’-GTTGGTCGTCAGGAAGAAGAG-3’；上游引物5’-CCCAAACATTGACAAATCCTAACC-3’，下游引物5’-CAACCAAGGAGGGTACCAGATG-3’；上游引物5’-GAAACGGAATCCTTGGTCAGAT-3’，下游引物5’-TTTCGGCTGCTGCTCTCCTA-3’；上游引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)

如圖1所示，和HepG2細(xì)胞相比，HepG2/ADM細(xì)胞大小不等且有明顯觸角。

3.2 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞增殖的影響

如圖2所示，選取細(xì)胞倍增時(shí)間和較小抑制濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物劑量，采用藥物作用48 h的IC5（3.21 μg/mL）、IC10（22.19 μg/mL）、IC20（183.19 μg/mL）分別作為PAE2低、中、高劑量。

圖1 HepG2 (A) 和HepG2/ADM (B) 細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖2 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞增殖的影響()

3.3 HepG2/ADM細(xì)胞的多藥耐藥性以及PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

如圖3所示，與對(duì)照組相比，化療藥物對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用較弱，HepG2/ADM細(xì)胞對(duì)不同化療藥物均存在耐藥性；PAE2聯(lián)合化療藥物可增強(qiáng)對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，HepG2/ADM細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性降低。如表1所示，HepG2/ADM細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、奧沙利鉑的耐藥倍數(shù)分別為2.18、1.87、4.78、3.10、2.00，PAE2對(duì)5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、奧沙利鉑的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.15、1.16、1.25、1.94、1.39。表明PAE2可逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的多藥耐藥性。

圖3 HepG2/ADM細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的多藥耐藥性以及PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

表1 HepG2/ADM對(duì)不同化療藥物的耐藥倍數(shù)以及PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)()

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

3.4 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞藥物累積的影響

利用阿霉素自發(fā)熒光的特點(diǎn)，觀察阿霉素在細(xì)胞中的累積。為了維持細(xì)胞耐藥性，用含阿霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，因此HepG2/ADM細(xì)胞熒光強(qiáng)于HepG2。如圖4和表2所示，與對(duì)照組相比，其余各組細(xì)胞中阿霉素累積水平明顯增加（＜0.05、0.01）；與模型組相比，PAE2中、高劑量組細(xì)胞中阿霉素累積水平顯著增加（＜0.01）。表明PAE2可抑制HepG2/ADM細(xì)胞對(duì)藥物的外排作用，HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性減弱。

圖4 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞藥物累積的影響(×400)

表2 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞藥物累積的影響()

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01

#< 0.05##< 0.01control group;**< 0.01model group

3.5 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組Bcl-2、cleaved Capase-9 p37、cleaved PARP蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01），Bax蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化；與模型組比較，PAE2可顯著升高Bax、cleaved Capase-9 p37蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01），并降低Bcl-2蛋白表達(dá)（＜0.05），呈劑量相關(guān)性，但cleaved PARP蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化。

3.6 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞多藥耐藥和酶介導(dǎo)的MDR途徑相關(guān)蛋白mRNA水平的影響

如表3所示，與對(duì)照比比較，模型組多藥耐藥相關(guān)蛋白、、mRNA水平顯著升高（＜0.01），mRNA水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，PAE2顯著下調(diào)、、mRNA水平（＜0.01），顯著升高mRNA水平（＜0.01），降低HepG2/ADM細(xì)胞的耐藥性。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與索拉非尼組比較：▲P＜0.05

表3 PAE2對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞多藥耐藥和酶介導(dǎo)的MDR途徑相關(guān)蛋白mRNA水平的影響()

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01；與索拉非尼組比較：▲＜0.05

##< 0.01control group;**< 0.01model group;▲< 0.05sorafenib group

4 討論

肝癌致死率極高，由于臨床診斷發(fā)現(xiàn)較晚，手術(shù)切除療效不佳[18]，且易對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性。5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、奧沙利鉑為臨床常用且易產(chǎn)生耐藥的化療藥物。5-氟尿嘧啶通過(guò)抑制胸腺核苷合成酶，從而抑制DNA合成，發(fā)揮抗腫瘤作用；阿霉素可抑制Top Ⅰ活性從而干擾轉(zhuǎn)錄、抑制RNA合成、干擾DNA復(fù)制，影響處于各個(gè)周期的細(xì)胞；長(zhǎng)春新堿可以抑制微管蛋白的聚合從而影響紡錘微管的形成，使細(xì)胞終止于細(xì)胞中期，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；環(huán)磷酰胺是氮芥類(lèi)抗腫瘤藥，經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)磷酸酶水解為氮芥后發(fā)揮細(xì)胞毒性，殺死腫瘤細(xì)胞；奧沙利鉑為鉑類(lèi)抗腫瘤藥，可與DNA形成交叉連接，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。雖然各種化療藥物的作用機(jī)制不同，但臨床應(yīng)用表明腫瘤對(duì)各種化療藥物均存在耐藥性。肝癌的多藥耐藥一直是臨床治療的一大難題，肝癌的多藥耐藥是多機(jī)制、多因素作用的結(jié)果[19]。藥物產(chǎn)生多藥耐藥的機(jī)制主要包括耐藥蛋白介導(dǎo)的MDR（MRP、BCRP、LRP）、酶系統(tǒng)異常導(dǎo)致的MDR（Top II、PKC）、DNA修復(fù)機(jī)制、微管與微管蛋白異常導(dǎo)致的MDR、凋亡通路受阻等[20-22]。化療藥物和生物藥逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的作用機(jī)制單一，中藥具有多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，研究前景廣闊。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊具有抗腫瘤活性，可逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥。本研究通過(guò)比較HepG2、耐藥細(xì)胞HepG2/ADM的形態(tài)差異以及HepG2/ADM細(xì)胞對(duì)5種臨床常用化療藥物的耐藥性，確定HepG2/ADM細(xì)胞的多藥耐藥作用。在逆轉(zhuǎn)MDR實(shí)驗(yàn)中，選擇PAE2的安全劑量IC20與化療藥物聯(lián)用，確定PAE2具有逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞多藥耐藥的作用。由于HepG2/ADM細(xì)胞可增加藥物外排，本研究利用阿霉素自發(fā)紅色熒光的特點(diǎn)，采用激光共聚焦觀察HepG2/ADM細(xì)胞中阿霉素的累積，結(jié)果顯示，PAE2組細(xì)胞中紅色熒光明顯增多，表明PAE2減少了藥物外排。

細(xì)胞凋亡是受多基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡，包括抑癌基因p53、Caspase家族、Bcl-2家族等[7]。Bax是人體最主要的凋亡基因，屬于Bcl-2家族，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對(duì)Bcl-2產(chǎn)生抑制作用。Bcl-2是細(xì)胞凋亡中重要的抑凋亡因子，可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗性，抑制大多數(shù)化療藥物引起的靶細(xì)胞凋亡，但對(duì)細(xì)胞損傷和DNA修復(fù)沒(méi)有影響。Caspase-9是Caspase家族的重要成員，受到凋亡刺激時(shí)可生成放大凋亡反應(yīng)的p37亞基，裂解的Caspase-9進(jìn)一步加工其他Caspase成員如Caspase-3、Caspase-7，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PARP是一類(lèi)涉及DNA損傷反應(yīng)的核蛋白酶家族，由PARP剪切的cleaved PARP被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)[23-25]。本研究結(jié)果顯示，PAE2可顯著上調(diào)HepG2/ADM細(xì)胞Bax、cleaved Caspase-9 p37蛋白表達(dá)，顯著下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。表明PAE2可上調(diào)促凋亡蛋白、下調(diào)抗凋亡蛋白，加速細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)與HepG2細(xì)胞相比，HepG2/ADM細(xì)胞中促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著增加，推測(cè)這可能是耐藥細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，耐藥細(xì)胞能量代謝快，通過(guò)促進(jìn)部分細(xì)胞凋亡，以獲得更多能量，后續(xù)研究有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

PKC是一種磷脂依賴性的胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。研究表明，細(xì)胞的多藥耐藥與BCRP、Top Ⅱ聯(lián)系密切[24-25]。結(jié)果顯示，PAE2顯著降低HepG2/ADM細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白（）、酶介導(dǎo)的MDR途徑中相關(guān)因子（、）mRNA水平，降低HepG2/ADM細(xì)胞的多藥耐藥性。多藥耐藥阻礙現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展，且細(xì)胞耐藥機(jī)制復(fù)雜。PAE2成分明確、作用靶點(diǎn)多樣，本研究從逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的角度為臨床克服多藥耐藥提供了一種新的可能，為其臨床研究奠定基礎(chǔ)。課題組后續(xù)將對(duì)多藥耐藥的體內(nèi)研究、能量代謝等進(jìn)一步探究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of polypeptide fromon reversing multi-drug resistance of hepatocellular carcinoma in HepG2/ADM cells

LI Cai-lin, LYU Hong, ZHANG Hong-han, WANG Yan-quan, PENG Fang

Yunnan Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,College of Pharmacy, Dali University, Dali 671000, China

To investigate the reverse effect of polypeptide from Meizhoudalian () (PAE2) on multi-drug resistance of HepG2/ADM cells.The drug resistance of HepG2/ADM cells to different chemotherapeutic drugs and effects of PAE2combined with chemotherapeutic drugs on proliferation of HepG2/ADM cells were detected by MTT; The influence of PAE2on drug accumulation was observed by Laser Scanning Confocal Microscopy; The expression of Bcl-2 associated X (Bax), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), cysteinyl aspartate specific proteinase 9 (Caspase-9) and poly ADP-ribose polymerase (PARP) were detected by Western blotting; qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of multiple drug resistance 1 (MDR1), breast cancer resistant protein (BCRP), protein kinase C (PKC) and topoisomerase Ⅱ (Top Ⅱ).Growth of HepG2/ADM cells was inhibited by PAE2with a time and dose dependent. PAE2reversed the multi-drug resistance of HepG2/ADM cells to different chemotherapeutic drugs; Level of doxorubicin in drug-resistant cells was increased by PAE2in a dose-dependent manner. Expressions of Bax, cleaved Caspase-9 p37 were significantly increased (< 0.05,0.01) and the expression of Bcl-2 was significantly decreased by PAE2in HepG2/ADM cells (< 0.01), the expression of cleaved PARP had no changed. Levels of,,andmRNA in HepG2/ADM cells were significantly reduced by PAE2.PAE2reversed the multidrug resistance of HepG2/ADM cells by reducing drug efflux, promoting cell apoptosis and reducing the expressions of drug-resistant protein.

Meizhoudalian () polypeptide; PAE2; hepatocellular carcinoma; multi-drug resistance; HepG2/ADM cells

R285.5

A

0253 - 2670(2021)01 - 0152 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.019

2020-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81560600）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（2017FH001-010）

李彩琳（1993—），云南曲靖人，碩士研究生，研究方向?yàn)榭鼓[瘤藥理學(xué)。E-mail: 253550890@qq.com

彭 芳，教授，碩士，研究方向?yàn)榭鼓[瘤藥理學(xué)。Tel: (0872)2257392 E-mail: pengfang6556@aliyun.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]