多重實(shí)時熒光定量PCR方法在高危型人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測中的應(yīng)用

王曉明，戴衛(wèi)健，余道軍，劉宏錢(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，杭州 310030；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 a. 檢驗(yàn)科，b. 輸血科，杭州 310006)

高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，hrHPV)的感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有近95%的宮頸癌由hrHPV的持續(xù)感染導(dǎo)致，而且hrHPV的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要條件[1-2]。

大多數(shù)女性的HPV感染屬于短暫的一過性感染，只有10%的感染長期持續(xù)[3]。雖然HPV DNA檢測的分析靈敏度很高，但其臨床特異性較低，導(dǎo)致其在臨床診斷中存在一定的局限性[4]。hrHPV感染宿主后的致癌過程需要其自身病毒基因組整合到宿主基因組中，當(dāng)HPV自身的核酸整合進(jìn)入宿主的基因組時，其轉(zhuǎn)錄水平將大幅度提高，預(yù)示著宮頸組織發(fā)生異常且在逐步惡化[5]。hrHPV E6/E7 mRNA的檢測可對病毒的活動程度和疾病的進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)控，這有利于宮頸癌的早期預(yù)防和早期治療，同時也為宮頸疾病提供更為可靠的臨床診斷依據(jù)[5]。本研究運(yùn)用多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(multiplex reverse transcript real time PCR, MRT-PCR)建立了一種簡便、快速、準(zhǔn)確、高效的hrHPV E6/E7 mRNA檢測方法，可實(shí)現(xiàn)一步法單管檢測14種hrHPV E6/E7 mRNA，為臨床更有效更特異地篩查宮頸病變提供了可靠的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2019年6—12月于杭州市第一人民醫(yī)院進(jìn)行HPV檢測并經(jīng)HPV DNA篩查試劑[人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)]篩查為HPV 14種高危亞型(HPV 16、18、31、33、35、39、52、45、51、56、58、59、66、68)陽性的宮頸分泌物標(biāo)本223例，患者年齡25～79歲。標(biāo)本采集后于2～8 ℃保存，72 h內(nèi)進(jìn)行檢測。單純皰疹病毒Ⅱ型、梅毒螺旋體、解脲支原體、人型支原體陽性分泌物標(biāo)本、淋病奈瑟菌、白念珠菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等保存菌種均來自杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科。

1.2主要儀器和試劑 數(shù)字PCR儀QX200TMDroplet DigitalTM(美國Bio-Rad公司)，熒光定量PCR儀Lightcycler 480(瑞士Roche公司)；HPV 6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、67、68、69、70、71、72、73、81、82、83、CP8304全基因組參考品(中國食品藥品檢定研究院)，HPV DNA篩查試劑人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法，深圳亞能公司)，Aptima?HPV檢測系統(tǒng)(美國Hologic公司)，DNA/RNA提取試劑盒TIANamp Virus DNA/RNA Kit(北京天根公司)，數(shù)字PCR試劑2×Preamplification Supermix(美國Bio-Rad公司)，DNase Ⅰ、RevertAid逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、Ribonuclease Inhibitor、dNTP(大連TaKaRa公司)。引物和探針委托上海生工公司合成，其中HPV 16、18、31、33、35、39、52的探針為羧基熒光素(FAM)標(biāo)記，HPV 45、51、56、58、59、66、68的探針為六氯熒光素(HEX)標(biāo)記，內(nèi)參基因GAPDH的探針為吲哚二羧菁(Cy5)標(biāo)記。

1.3方法

1.3.1薄層液基細(xì)胞學(xué)檢測(thinprep cytologic test，TCT) 用ThinPrep2000制片系統(tǒng)對所采集的223例HPV疑似感染患者樣本進(jìn)行液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)處理，固定及染色后進(jìn)行鏡檢。檢查結(jié)果采用TBS系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞分類診斷。鱗狀細(xì)胞劃分等級包括：正常、沒有明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCUS)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、腺癌(AC)。

1.3.2宮頸組織病理學(xué)檢測 所有223例患者均行陰道鏡下多點(diǎn)活檢并在規(guī)定時間內(nèi)進(jìn)行病理檢查。宮頸組織病理學(xué)檢測是宮頸病變鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。宮頸組織病理依據(jù)《病理學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)分為：正?；蜓装Y、異型上皮細(xì)胞局限于宮頸上皮的下1/3(CIN Ⅰ)、異型上皮細(xì)胞累及宮頸上皮的下1/3～2/3(CIN Ⅱ)、異型上皮細(xì)胞超過宮頸上皮全層的2/3或累及全層宮頸腺但未突破基底膜(CIN Ⅲ)以及浸潤癌。病理檢查為CIN Ⅱ及以上級別被認(rèn)為是宮頸癌前病變。TBS分類和組織病理學(xué)相對應(yīng)的節(jié)點(diǎn)分別是：LSIL對應(yīng)CIN Ⅰ，HSIL對應(yīng)CIN Ⅱ和CIN Ⅲ。

1.3.3HPV E6/E7 mRNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備 HPV E6/E7 mRNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備與驗(yàn)證參考黃杰等[6]所用方法并經(jīng)過測序驗(yàn)證，PCR模板采用14種hrHPV全基因組參考品。

1.3.4Aptima?HPV檢測HPV E6/E7 mRNA 用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(TMA)技術(shù)檢測14種hrHPV E6/E7 mRNA，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。按照Aptima?HPV試劑說明書進(jìn)行。

1.3.5一步法MRT-PCR法檢測HPV E6/E7 mRNA 用TIANamp Virus DNA/RNA Kit提取RNA，按照試劑盒說明書操作，用50 μL DEPC水洗脫。取提取的RNA 9 μL,加入2×DNase Ⅰ buffer 10 μL, DNase Ⅰ 1 μL，37 ℃ 30 min。一步法MRT-PCR反應(yīng)總體積為40 μL，包括消化好的RNA模板2 μL，5×RT Buffer 4 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，30條10 μmol/L的擴(kuò)增引物各0.4 μL，15條10 μmol/L探針各0.2 μL,200 U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，5 U/μL Taq酶1 μL，用RNase Free H2O補(bǔ)足40 μL。引物及探針序列見表1，其中GAPDH-F、GAPDH-R、GAPDH-P分別為內(nèi)參的擴(kuò)增引物和探針。反應(yīng)條件為：42 ℃ 30 min，80 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，40個循環(huán)(94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，并于72 ℃采集FAM、HEX、Cy5 3個通道熒光信號，反應(yīng)均在LightCycler 480 PCR儀上完成，以循環(huán)閾值(Ct)<38作為標(biāo)本和內(nèi)參陽性判斷閾值，內(nèi)參Ct值>38作為標(biāo)本不合格閾值。

表1 引物及探針序列

1.3.6一步法MRT-PCR的靈敏度與特異性 制備的14種hrHPV E6/E7 mRNA標(biāo)準(zhǔn)品中提取的RNA用數(shù)字PCR進(jìn)行定量，根據(jù)測得的拷貝數(shù)將其用含10 ng/mL人基因組的TE溶液按10倍梯度稀釋成1×108copies/μL至1×101copies/μL。每個梯度取2 μL RNA作為模板進(jìn)行MRT-PCR反應(yīng)，以測定其靈敏度，每個梯度重復(fù)檢測20次，以20次重復(fù)檢測中19次為陽性的濃度梯度作為該型別的檢出限。

用TIANamp Virus DNA/RNA Kit提取淋病奈瑟菌、白念珠菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌以及單純皰疹病毒Ⅱ型、梅毒螺旋體、解脲支原體、人型支原體陽性分泌物標(biāo)本核酸，不經(jīng)過DNaseⅠ處理，取2 μL作為模板，同時取HPV 6、11、26、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、73、81、82、83全基因組參考品2 μL作為模板，進(jìn)行MRT-PCR反應(yīng)，以評估其特異性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Kappa檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算Kappa值來評判2種方法檢測結(jié)果的一致性。Kappa≥0.75，說明2種方法檢測結(jié)果的一致性較好；0.4≤Kappa<0.75，說明一致性一般；Kappa<0.4，說明一致性較差。

2 結(jié)果

2.1MRT-PCR檢測的靈敏度與特異性分析 以梯度稀釋的14種hrHPV標(biāo)準(zhǔn)品RNA為模板，進(jìn)行多重PCR檢測。其中，HPV 16、18、31、33、35、39、45、66、68等9種型別能最低檢測至10 copies/μL，而HPV 51、52、56、59、58等5種型別最低檢測至100 copies/μL(圖1)。用MRT-PCR法檢測14種高危型以外的其余18種HPV型別以及女性生殖道中其他常見病原體包括淋病奈瑟菌、白念珠菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、單純皰疹病毒Ⅱ型、梅毒螺旋體、解脲支原體、人型支原體陽性等的核酸，檢測結(jié)果均為陰性，表現(xiàn)出良好的檢測特異性。

圖1 多重實(shí)時熒光定量PCR檢測HPV16 RNA的敏感性

2.2TCT檢測和組織病理學(xué)診斷 223例臨床樣本的TCT檢測和組織病理學(xué)診斷結(jié)果見表2。

表2 組織病理學(xué)診斷結(jié)果

2.32種HPV E6/E7 mRNA檢測方法比較 結(jié)果見表3。2種檢測方法的總符合率分析結(jié)果顯示，Kappa值為0.910(95%置信區(qū)間)。

表3 MRT-PCR與Aptima? HPV的分組情況

2.4HPV E6/E7 mRNA與宮頸病變關(guān)聯(lián)性分析 Aptima?HPV檢測結(jié)果顯示，223例標(biāo)本中共有33例樣本為陽性，包括12例(6.06%)正常樣本，13例(81.25%)CIN Ⅰ級樣本，6例(85.71%)介于CIN Ⅱ級和CIN Ⅲ級樣本以及2例(100%)SCC樣本。以組織病理結(jié)果為CIN Ⅰ及以上的作為陽性，Aptima?HPV臨床檢測敏感性為84.0%，特異性為94.0%，陽性預(yù)測值為63.6%，陰性預(yù)測值為97.9%。223例樣本使用一步法MRT-PCR進(jìn)行hrHPV E6/E7 mRNA的檢測，結(jié)果為陽性的樣本有32例，包括包括11例(5.56%)正常樣本，13例(81.25%)CIN Ⅰ級樣本，6例(85.7%)介于CIN Ⅱ級和CIN Ⅲ級樣本以及2例(100%)SCC樣本。以組織病理結(jié)果為CIN Ⅱ及以上的作為陽性，MRT-PCR檢測方法臨床檢測敏感性為84.0%，特異性為94.4%，陽性預(yù)測值為65.6%，陰性預(yù)測值為97.9%。

3 討論

目前市場上已有幾種HPV E6/E7 mRNA檢測的產(chǎn)品。其中Hologic Gen-Probe 的Aptima HPV Assay是目前美國食品藥品監(jiān)督管理局最新并且是唯一批準(zhǔn)的檢測14種hrHPV E6/E7 mRNA的新一代檢測產(chǎn)品，但其檢測設(shè)備呈封閉式，國內(nèi)的普及率低。PRETECT HPV-Proofer產(chǎn)品檢測的型別偏少，只能檢測5種hrHPV E6/E7 mRNA，包括HPV 16、18、31、33和45。另外， Kodia的hrHPV E6/E7 mRNA定量檢測試劑盒是我國國家食品藥品管理局唯一批準(zhǔn)的HPV E6/E7 mRNA檢測產(chǎn)品，由于采用的為b-DNA信號放大法，操作步驟比較繁瑣，操作時間較長。本研究建立的MRT-PCR法適用于幾乎所有熒光定量PCR儀，可檢測14種hrHPV E6/E7 mRNA且檢測時間短，操作簡便。分別采用MRT-PCR法及Aptima?HPV檢測系統(tǒng)對223例臨床標(biāo)本中14種hrHPV E6/E7 mRNA進(jìn)行檢測，結(jié)果表明2種方法檢測結(jié)果具有較好的一致性。此外，223例臨床標(biāo)本 hrHPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果與細(xì)胞病理學(xué)以及組織病理學(xué)檢測結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞學(xué)病變程度的加重，hrHPV E6/E7 mRNA的陽性檢出率也逐漸升高。這也進(jìn)一步證明HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與宮頸細(xì)胞病變的嚴(yán)重程度相關(guān)。

綜上所述，本研究建立了一種操作簡便、適用普遍、檢測快速兼具高臨床靈敏度和特異性的hrHPV E6/E7 mRNA檢測方法，為臨床上宮頸病變篩查提供了一種可靠的手段，在宮頸病變篩查中具有重要的臨床應(yīng)用價值。