滲透壓選擇性裂解法在MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的應(yīng)用

張麗娜，陳莎，楊柳，胡成進(jìn)(.杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，杭州 3003；.解放軍第九六〇醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 50000)

血流感染(blood stream infection，BSI)具有較高發(fā)病率和死亡率，我國院內(nèi)BSI致死率可高達(dá)30%～40%[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，BSI病原菌鑒定報(bào)告時(shí)間每延遲1 h，患者存活率降低7.6%[2-3]。因此，準(zhǔn)確快速鑒定病原菌及合理的抗菌藥物治療對(duì)于BSI患者的生存率和預(yù)后極其關(guān)鍵。目前，BSI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)依然是血培養(yǎng)，而實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)方法是陽性血培養(yǎng)標(biāo)本分離培養(yǎng)出單克隆菌落后進(jìn)行生化鑒定和藥敏試驗(yàn)，一般耗時(shí)48～72 h，極大地延遲血培養(yǎng)陽性結(jié)果的報(bào)告時(shí)間，從而可能耽誤患者的后續(xù)治療?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是一種近年來發(fā)展的新技術(shù)，可用于微生物病原菌的鑒定，已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。本研究嘗試使用滲透壓選擇性裂解法直接用于MALDI-TOF MS檢測(cè)，可極大地縮短血培養(yǎng)陽性周轉(zhuǎn)時(shí)間(turn-around time，TAT)，為臨床抗感染治療提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年12月至2019年3月杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心微生物室送檢的陽性血培養(yǎng)瓶179例，剔除同一患者短時(shí)間送檢的多套血培養(yǎng)標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套鑒定卡、Bact/ALERT3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀(法國生物梅里埃公司)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀及基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)(珠海美華公司)，甲酸、乙腈、三氟乙酸(Sigma公司)，快速革蘭染液(珠海貝索公司)，血瓊脂平板、麥康凱平板、巧克力平板(鄭州博賽公司)。

1.3方法

1.3.1血培養(yǎng)涂片染色鏡檢 血培養(yǎng)儀陽性報(bào)警后，取出血培養(yǎng)陽性報(bào)警瓶抽取培養(yǎng)液涂片行革蘭染色，記錄鏡檢結(jié)果，排除假陽性干擾。

1.3.2傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定 根據(jù)涂片結(jié)果，轉(zhuǎn)種哥倫比亞血瓊脂平板和巧克力平板，置于CO2環(huán)境中培養(yǎng)18～24 h，選擇適合鑒定板條，用Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，記錄結(jié)果。

1.3.3MALDI-TOF MS 取出陽性血培養(yǎng)瓶混勻后，注射器抽取1.5 mL培養(yǎng)液于1.5 mL EP管中(a)，600×g離心10 s，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，3 000×g離心60 s后棄上清液(b)，加入1.5 mL裂解液(8.29 g NH4Cl，0.037 g EDTA-2Na，1 g KHCO3溶于1 L蒸餾水配制而成)，室溫放置3 min后3 000×g離心60 s，棄上清液(c)。加入900 μL乙醇重懸，13 000 r/min離心2 min，棄上清液，再次離心，使用移液槍完全去除殘余的上清液，整個(gè)過程不應(yīng)觸碰沉淀，室溫下干燥沉淀2～3 min，加入70%甲酸和乙腈，吹打混勻，13 000 r/min離心2 min，吸取1 μL蛋白質(zhì)溶液(d)，點(diǎn)樣于MALDI靶板上，干燥后加入1 μL HCCA基質(zhì)溶液，室溫干燥，采用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置：線性正性模式，氮激光器波長(zhǎng)377 nm，采集相對(duì)分子質(zhì)量為2 000～20 000的蛋白質(zhì)指紋圖譜，采集到的譜圖通過軟件進(jìn)行校正，然后與數(shù)據(jù)庫中的圖譜進(jìn)行比對(duì)。軟件根據(jù)微生物鑒定得到相應(yīng)分?jǐn)?shù)，判斷分?jǐn)?shù)越高，鑒定準(zhǔn)確性的可信度越高：1.7分以下不可信，1.7～2.0屬水平可信，大于2.0種水平可信。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料以率表示，率的比較采用四格表的卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1革蘭染色與傳統(tǒng)鑒定法結(jié)果 共179例血培養(yǎng)瓶呈陽性結(jié)果，其中3例為混合菌感染，1例為厭氧菌感染，2例涂片未找到細(xì)菌，查看梅里埃血培養(yǎng)儀報(bào)陽曲線發(fā)現(xiàn)，其曲線不連續(xù)，為假陽性結(jié)果。另外包括83例(47.1%)革蘭陰性桿菌，72例(26.7%)革蘭陽性球菌，1例(0.57%)革蘭陰性球菌，11例(6.3%)革蘭陽性桿菌，6例(3.4%)真菌，經(jīng)過16～24 h轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后采用Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)可以鑒定出所有細(xì)菌。

2.2前處理除雜效果及MALDI-TOF MS的譜圖對(duì)比 以1例外周血培養(yǎng)大腸埃希菌為例，通過整個(gè)前處理操作過程中的外觀比對(duì)，可見在第d步驟時(shí)除雜效果達(dá)到最好，得到的譜峰豐度最高，鑒定分值最優(yōu)。見圖1。

注：A，血培養(yǎng)陽性標(biāo)本原液；B，血培養(yǎng)陽性標(biāo)本原液低速離心后沉淀；C，血培養(yǎng)陽性標(biāo)本原液經(jīng)低速離心、裂解液裂解、離心后沉淀；D，血培養(yǎng)陽性標(biāo)本原液經(jīng)低速離心、裂解液裂解、甲酸萃取、離心后上清。

2.3MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果 174份單種菌血培養(yǎng)的種、屬水平鑒定的符合率分別是67.8%(118/174)、85.1%(148/174)。革蘭陰性桿菌的種、屬水平鑒定的符合率是74.7%(62/83)、91.6%(76/83)，其中臨床常見菌株大腸埃希菌的種、屬水平的符合率是90.6%(29/32)、96.9%(31/32)，肺炎克雷伯菌的種、屬水平符合率是72.7%(8/11)、81.8%(9/11)，銅綠假單胞菌的種、屬水平符合率是80%(4/5)、100%(5/5)，洋蔥伯克霍爾德菌的種、屬水平符合率是68.8%(11/16)、87.5%(14/16)；革蘭陽性球菌的種、屬水平鑒定符合率是69.4%(50/72)、80.6%(58/72)，其中人葡萄球菌的種、屬水平的符合率是73.7%(14/19)、78.9%(15/19)，頭狀葡萄球菌的種、屬符合率是80%(12/15)、86.7%(13/15)，糞腸球菌的種、屬水平符合率是66.7%(4/6)、83.3%(5/6)，革蘭陽性桿菌的種、屬水平符合率是27.3%(3/11)、63.6%(7/11)，念珠菌的種、屬水平符合率是33.3%(2/6)、100%(6/6)。3例復(fù)合菌感染的血培養(yǎng)陽性鑒定分值均小于1.70，結(jié)果不可信。鑒定結(jié)果見表1。革蘭陽性桿菌鑒定種水平的準(zhǔn)確率顯著低于革蘭陰性桿菌(P<0.05)和革蘭陽性球菌(P<0.05)，而革蘭陰性桿菌鑒定種水平的準(zhǔn)確率略高于革蘭陽性球菌，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3 討論

MALDI-TOF MS的最大優(yōu)勢(shì)在于可直接鑒定血培養(yǎng)瓶中的病原菌，省去了轉(zhuǎn)種于固體培養(yǎng)基孵育的時(shí)間，為臨床爭(zhēng)取時(shí)間。大量文獻(xiàn)[4-5]表明，不同的標(biāo)本預(yù)處理方法可用于MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽性瓶病原菌，而不需要轉(zhuǎn)種培養(yǎng)；前處理方法不同，MALDI-TOF MS鑒定的準(zhǔn)確率也會(huì)有所差異。本研究使用滲透壓選擇裂解法預(yù)處理對(duì)血培養(yǎng)陽性瓶中的病原菌進(jìn)行直接鑒定，首先根據(jù)細(xì)胞密度的差異，離心后細(xì)菌菌體位于沉淀上層，然后利用氯化銨溶液進(jìn)一步裂解殘余的血細(xì)胞，獲得相對(duì)較純的細(xì)菌菌體，最后采用甲酸萃取法提取細(xì)菌蛋白質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF MS直接鑒定。甲酸萃取法的目的是破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，產(chǎn)生更多蛋白質(zhì)譜，并且甲酸提取法中水和乙醇能洗掉培養(yǎng)基內(nèi)的雜質(zhì)，2種溶劑混合作用可以將菌體表面和細(xì)胞內(nèi)的高峰強(qiáng)度的蛋白質(zhì)提取出來，當(dāng)細(xì)菌量少、70%甲酸和乙腈的量多時(shí)，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)度不夠的峰。如果細(xì)菌數(shù)量太大而70%甲酸和乙腈的量少時(shí)會(huì)造成檢測(cè)器的飽和，從而只有優(yōu)勢(shì)峰被檢測(cè)到，后者還會(huì)造成MALDI-TOF MS系統(tǒng)的污染，干擾鑒定準(zhǔn)確性。本研究參照文獻(xiàn)報(bào)道，70%甲酸和乙腈的量為菌體沉淀的6倍，鑒定準(zhǔn)確性最好[6]。

本研究對(duì)174例單種菌陽性血培養(yǎng)直接進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定，結(jié)果顯示革蘭陽性桿菌鑒定種水平的準(zhǔn)確率顯著低于革蘭陰性桿菌，這與國內(nèi)外學(xué)者的研究相符合[7]，可能與革蘭陰性桿菌生長(zhǎng)速度快，相對(duì)比較容易達(dá)到MALDI-TOF MS鑒定的檢出限有關(guān)。另外，部分質(zhì)譜得分低的革蘭陰性桿菌，可能由于80%的血培養(yǎng)瓶含有活性炭或樹脂等抗菌藥物吸附劑，但其中的活性炭成分可能會(huì)干擾蛋白質(zhì)譜峰。對(duì)真菌的鑒定效果不理想，可能因?yàn)椋?1)真菌的細(xì)胞壁比較厚，結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌，不能很好地與甲酸結(jié)合，從而蛋白質(zhì)不能完全被釋放出來；(2)真菌生長(zhǎng)緩慢，血培養(yǎng)瓶中數(shù)量少導(dǎo)致靶點(diǎn)涂抹時(shí)不均勻，不能形成良好的結(jié)晶譜圖[8]；(3)本實(shí)驗(yàn)使用的國產(chǎn)質(zhì)譜儀所使用的數(shù)據(jù)庫不完善。但是鑒于本研究中樣本數(shù)量較少，無法進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究對(duì)3例復(fù)合菌的鑒定，沒有1例鑒定成功。MALDI-TOF MS不適合作復(fù)合菌感染的鑒定[9]，而Schubert等[10]在研究中提出應(yīng)用新的計(jì)算程序和新的數(shù)據(jù)庫直接鑒定混合感染的血培養(yǎng)標(biāo)本，此研究為MALDI-TOF MS直接鑒定混合菌感染的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本提供了可能。另外，本研究發(fā)現(xiàn)1株被鑒定錯(cuò)誤的大腸埃希菌(得分為2.02分)，實(shí)際上梅里埃儀器結(jié)果是99%的日勾維腸桿菌，這可能與本文使用質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)庫中參考指紋圖譜數(shù)量少有關(guān)。另外，由于成本問題，本研究中沒有用第3種方法來驗(yàn)證鑒定結(jié)果的可靠性，以及樣本量較少，使得統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能有所偏差，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，MALDI-TOF MS 采用滲透壓裂解法對(duì)血培養(yǎng)陽性標(biāo)本直接鑒定，大大縮短了TAT，有助于臨床醫(yī)生對(duì)BSI患者作出及時(shí)準(zhǔn)確的判斷，適宜在微生物室常規(guī)開展。但是，血培養(yǎng)瓶成分、樣品的前處理方法、質(zhì)譜儀型號(hào)、判斷標(biāo)準(zhǔn)的差異均會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步優(yōu)化方法，提高質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確性。