骨質(zhì)疏松患者外周血差異表達(dá)miR-19b調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制研究*

彭松林 王尚 陳高揚(yáng)

（深圳市人民醫(yī)院脊柱外科，暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東深圳 518020）

骨質(zhì)疏松是最為常見的年齡相關(guān)性骨科疾病，特點(diǎn)是骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[1-3]。當(dāng)前全球范圍內(nèi)約有2 億骨質(zhì)疏松癥患者，其中890 萬并發(fā)骨折癥狀，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量并大幅增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[4]。骨質(zhì)疏松癥的病因包括女性絕經(jīng)后狀態(tài)、年齡增長、性腺功能減退或卵巢早衰、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、缺鈣、吸煙、酗酒和長期使用某些藥物（如糖皮質(zhì)激素、抗凝劑、抗驚厥藥、癌癥化療藥物等）[5-7]。隨著人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐年升高，成為當(dāng)前世界性的難題。骨質(zhì)疏松癥主要由于骨代謝過程中骨形成和骨吸收失衡所致，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[2,8,9]。深入了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示骨代謝過程中新的作用機(jī)制和靶點(diǎn)，為骨質(zhì)疏松癥的病理機(jī)制提供新的理論依據(jù)，為骨質(zhì)疏松癥預(yù)防和治療提供全新的策略和思路。

微小RNA（miRNA）被證實(shí)可在轉(zhuǎn)錄后通過抑制目標(biāo)基因調(diào)控疾病進(jìn)展[10-12]，已有研究報(bào)道m(xù)iRNA在骨質(zhì)疏松中差異表達(dá)且發(fā)揮重要調(diào)控作用[13,14]。然而，miRNA 在骨質(zhì)疏松性椎體骨折患者外周血中的表達(dá)譜變化尚不明確，血漿中差異表達(dá)miRNAs在成骨過程中的作用尚不清楚。本研究檢測(cè)伴有或不伴有椎體骨折的骨質(zhì)疏松癥患者相對(duì)于健康對(duì)照的miRNA 差異表達(dá)譜，通過生物信息學(xué)分析篩選出成骨相關(guān)miRNA 并進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)BMSCs 成骨分化的調(diào)控作用。目的是為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療提供可靠的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 患者入組及標(biāo)本收取

納入本研究的所有受試者均為就診于深圳市人民醫(yī)院脊柱外科的女性患者，患者年齡60～70歲。按骨密度值（T 值）和是否伴有骨折分為3 組：骨量正常組（T≥-1.0 SD），單純骨質(zhì)疏松組（T≤-2.5 SD），骨質(zhì)疏松伴骨折組（T≤-2.5 SD），每組6 例。以上各組均排除患有其他器質(zhì)性病變（如高血壓、糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨壞死等）的患者。受試者知情同意后，取外周血4～5 ml 于抗凝管中，梯度密度離心法分離外周血血漿。本研究由深圳市人民醫(yī)院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 RNA測(cè)序及miRNA差異表達(dá)譜分析

應(yīng)用FlexiGene RNA試劑（Qiagen）提取上述外周血血漿RNA，各樣品的RNA 純度（OD260/280＞1.8）和濃度（50 ng/ml）均符合測(cè)序要求。RNA 測(cè)序法檢測(cè)骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松伴骨折患者相對(duì)于健康對(duì)照組的miRNA表達(dá)譜。差異表達(dá)倍數(shù)≥2或≤-2，且P＜0.05的miRNA 為差異表達(dá)miRNA[15]。根據(jù)表達(dá)趨勢(shì)，篩選出在3組（健康對(duì)照組、骨質(zhì)疏松組、骨質(zhì)疏松伴骨折組）之間梯度表達(dá)的miRNA。

1.3 miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及功能分析

為了進(jìn)一步了解目標(biāo)miRNA可能調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制，通過microRNA.org（http://www.microRNA.org/）、TargetScan（http://www.targetsca-n.org/vert_72/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、miRDB（http://mirdb.org/）四個(gè)數(shù)據(jù)庫，預(yù)測(cè)目標(biāo)miRNA的靶基因，應(yīng)用維恩分析篩選出4個(gè)數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測(cè)出的靶mRNA[15,16]。KEGG 分析用于揭示目標(biāo)miRNA 的靶mRNA 的通路富集情況。結(jié)合基因功能注釋和已有研究，預(yù)測(cè)靶mRNA 的潛在功能，進(jìn)一步確定目標(biāo)miRNA的下游靶點(diǎn)。

1.4 miRNA敲低和過表達(dá)

將人BMSCs 細(xì)胞系均勻鋪種于6 孔培養(yǎng)板上并置于5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中，設(shè)計(jì)合成miR-19b 的mimics、mimics control、inhibitor 和inhibitor control（吉瑪基因，蘇州），并應(yīng)用Liposomes 2000（賽默飛，美國）轉(zhuǎn)入人BMSCs細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)miR-19b及其下游基因表達(dá)水平變化。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞收集后，應(yīng)用TRIzol（賽默飛，美國）提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit（Takara，日本）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)miRNA（miR-19b）和mRNA（PTEN及下游基因、成骨相關(guān)基因）qRT-PCR 引物（生工生物，上海），應(yīng)用熒光定量試劑盒（GeneCopoeia，廣州）檢測(cè)miRNA 和mRNA 表達(dá)量，U6 和GAPDH 作為參照基因，2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色及成骨marker檢測(cè)

將miR-19b mimics 或inhibitor 轉(zhuǎn)染后的人BMSCs細(xì)胞系均勻鋪種于6孔培養(yǎng)板和48孔板，并置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中。鋪種24 h更換為成骨誘導(dǎo)液（賽業(yè)生物，蘇州），成骨誘導(dǎo)后第3、7、10、14、18、21天行茜素紅染色（48孔板），并應(yīng)用尼康顯微鏡進(jìn)行拍照。于成骨誘導(dǎo)后第7、14 天應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)成骨標(biāo)志基因OPN、RUNX2、ALP表達(dá)量（6孔板）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

T 檢驗(yàn)用于比較組間差異，P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05和差異倍數(shù)≥2或≤-2設(shè)為差異表達(dá)miRNA 的標(biāo)準(zhǔn)，qRT-PCR 結(jié)果呈現(xiàn)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，火山圖、熱圖、柱狀圖由prizm 7.0 繪制，韋恩圖由FUNRICH 軟件繪制，miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖由Cytoscape繪制。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松患者外周血miRNA差異表達(dá)譜

外周血樣本測(cè)序后，我們分析了骨質(zhì)疏松（伴有或不伴有骨折）患者組相對(duì)于健康受試者對(duì)照組的miRNA 表達(dá)譜（圖1A），以及骨質(zhì)疏松伴有骨折患者組相對(duì)于骨質(zhì)疏松不伴有骨折患者組的miRNA表達(dá)譜（圖1B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松（伴有或不伴有骨折）患者外周血中有384 個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中118 個(gè)上調(diào)表達(dá)，266 個(gè)下調(diào)表達(dá)。而相對(duì)于骨質(zhì)疏松不伴有骨折患者，骨質(zhì)疏松伴有骨折患者外周血中有338 個(gè)差異表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，9 個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNA 與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)（圖1C），其中miR-19b相關(guān)性最強(qiáng)，但miR-19b在骨質(zhì)疏松骨代謝中的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

圖1 骨質(zhì)疏松患者外周血miRNA差異表達(dá)譜

2.2 PTEN為miR-19b潛在靶點(diǎn)

為了進(jìn)一步了解miR-19b 可能調(diào)控BMSCs 成骨分化的機(jī)制，我們通過microRNA.org、TargetScan、miRWalk、miRDB 四個(gè)數(shù)據(jù)庫（圖2A），共同預(yù)測(cè)出靶mRNA 37 個(gè)（圖2B）。KEGG 提示這些靶mRNA 通路富集于cAMP通路、趨化因子通路、GnRH通路等。進(jìn)一步通過基因功能分析和文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，PTEN 基因?yàn)閙iR-19b的潛在作用靶點(diǎn)（圖2C）。

2.3 miR-19b通過靶向PTEN調(diào)控AKT/GSK3β通路表達(dá)

圖2 miR-19b靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

KEGG 通路分析提示PTEN 可抑制AKT，進(jìn)而通過介導(dǎo)下游通路表達(dá)變化，應(yīng)用miR-19b mimics 和inhibitor 在BMSCs 內(nèi)構(gòu)建miR-19b 過表達(dá)或敲低模型，轉(zhuǎn)染48 h 后，檢測(cè)PTEN、AKT，以及AKT 下游潛在基因TSC1、TSC2、FOXO1、RAF1、GSK3β、mTOR 表達(dá)量，結(jié)果顯示：miR-19b 在敲低/過表達(dá)后，PTEN、AKT 表達(dá)變化與預(yù)測(cè)相符，而AKT 下游基因中，僅GSK3β 表達(dá)量有明顯變化，且與AKT 表達(dá)趨勢(shì)一致（圖3）。

2.4 miR-19b可促進(jìn)BMSCs成骨分化

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-19b 是否促進(jìn)BMSCs 成骨分化，應(yīng)用miR-19b mimics 和inhibitor 轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，于第3、7、10、14、18、21天行茜素紅染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-19b后BMSCs成骨分化能力顯著增強(qiáng)，而敲低miR-19b 后BMSCs 成骨分化能力顯著減弱（圖4A）。轉(zhuǎn)染后第7、14 天成骨標(biāo)志基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-19b后成骨標(biāo)志基因OPN、RUNX2、ALP 表達(dá)量顯著增加，而敲低miR-19b后上述成骨標(biāo)志基因表達(dá)量顯著減低（圖4B和4C）。

3 討論

圖3 miR-19b敲低/過表達(dá)后，PTEN下游潛在靶基因表達(dá)變化

隨著人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥日益成為影響老年人生命安全和生活質(zhì)量的世界性難題[17,18]。然而，當(dāng)前臨床上治療骨質(zhì)疏松的藥物主要通過抑制骨吸收或促進(jìn)骨形成來增加骨量，但存在價(jià)格昂貴、療效不明確、長期使用有下頜骨壞死等并發(fā)癥的弊端[19,20]。如何安全有效地早期診斷、早期治療骨質(zhì)疏松，是當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)面臨的亟需解決的問題[8]。在骨質(zhì)疏松癥發(fā)展過程中，BMSCs 向成骨細(xì)胞分化的能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致骨形成減少[21]。在分子水平探討骨質(zhì)疏松BMSCs 成骨分化減弱的機(jī)制，對(duì)了解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和開發(fā)新的骨質(zhì)疏松診療方法具有重要意義。

miRNAs是非編碼RNA家族的成員，已被證實(shí)在不同疾病組織以及相同組織的不同階段存在差異表達(dá)并發(fā)揮重要調(diào)控功能。已有研究報(bào)道m(xù)iRNAs 在轉(zhuǎn)錄后通過作用于骨形成相關(guān)基因表達(dá)而參與BMSCs 成骨分化及骨形成。例如，miR-1-3p 通過靶向fryzzled 相關(guān)蛋白1 進(jìn)而調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化以預(yù)防骨質(zhì)疏松[22]，而miR-532-5p參與了前叉盒O1和成骨細(xì)胞分化對(duì)骨質(zhì)疏松的調(diào)節(jié)[23]。miR-16-5p 通過直接靶向VEGFA 調(diào)節(jié)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[24]，miR-765通過調(diào)控BMP6/Smad1/5/9信號(hào)通路，靶向BMP6抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[25]。

圖4 miR-19b可促進(jìn)BMSCs成骨分化

本研究發(fā)現(xiàn)miR-19b 在骨質(zhì)疏松患者中顯著下調(diào)，且在骨質(zhì)疏松伴骨折患者外周血中下調(diào)尤為明顯，提示miR-19b與骨量丟失呈負(fù)相關(guān)。miR-19b在腫瘤生長調(diào)節(jié)中的作用已明確，Wei 等的研究發(fā)現(xiàn)miR-19b通過負(fù)性調(diào)節(jié)神經(jīng)肽-1抑制胃癌的發(fā)生[26]，Tang 等的研究發(fā)現(xiàn)miR-19b 可促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并抑制其凋亡[27]。然而，miR-19b是否直接參與了成骨的調(diào)控，目前尚不清楚。為了進(jìn)一步明確miR-19b調(diào)控成骨的作用及機(jī)制，我們首先通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)出miR-19b 的潛在下游靶mRNA共37個(gè)，并通過功能分析預(yù)測(cè)出PTEN為miR-19b在成骨調(diào)控中的潛在作用靶點(diǎn)。PTEN 作為一種磷酸酶，主要通過抑制AKT 及其下游信號(hào)（如mTOR 通路、GSK3β 通路、FOXO 通路、MAPK 通路等）傳導(dǎo)來發(fā)揮作用。

通過敲低/過表達(dá)miR-19b并檢測(cè)其下游基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)PTEN、AKT、GSK3β表達(dá)變化與敲低/過表達(dá)miR-19b 密切相關(guān)，提示PTEN/AKT/GSK3β 為miR-19b 下游通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-19b 促進(jìn)成骨的功能，我們?cè)贐MSCs中敲低/過表達(dá)miR-19b，通過茜素紅染色和成骨標(biāo)志基因檢測(cè)證實(shí)miR-19b 可促進(jìn)BMSCs成骨分化。

綜上所述，本研究通過外周血測(cè)序揭示了miRNA 在骨質(zhì)疏松中的差異表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)miR-19b 與骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究證實(shí)，miR-19b 可通過PTEN/AKT/GSK3β 通路促進(jìn)BMSCs的成骨分化，為臨床骨質(zhì)疏松的早期診斷和治療提供可靠的分子標(biāo)志物和全新的策略。