嵌合抗原受體T細(xì)胞療法在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用與展望

那迪娜·帕爾哈提，嚴(yán) 妍，車千紀(jì)，羅 菁，劉鑫男，李 斌

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma）是成人最常見且最具侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤，在世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）腫瘤分級(jí)中處于Ⅳ級(jí)，屬高度惡性。通常所說的繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是指少數(shù)從先前診斷為WHO腫瘤分級(jí)為Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)的膠質(zhì)瘤演變而來的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤占原發(fā)性惡性腦腫瘤的45.6%，但與乳腺癌（發(fā)病率71.2/10萬）或前列腺癌（發(fā)病率201.4/10萬）等癌癥相比，其發(fā)病率（3.1/10萬）較低［1］。自2003年以來，只有2種化學(xué)治療藥物（替莫唑胺和卡氮芥）被批準(zhǔn)用于治療新診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者。在2015年，腫瘤治療電場(chǎng)（tumor-treating fields，TTFields）被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)為新的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療方式，但使用此方式的同時(shí)需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)治療（包括術(shù)后放射治療和輔助化學(xué)治療）［2］。嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptormodified Tcell，CAR-T）療法在治療血液腫瘤中取得了巨大成功，在治療實(shí)體腫瘤中效果卻不夠理想，然而在治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤方面具有潛在的突破性。

1 CAR-T療法在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用

1.1 針對(duì)主要抗原的臨床研究

CAR-T療法的關(guān)鍵在于其對(duì)腫瘤特異性抗原的識(shí)別。目前應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的抗原包括人表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor variantⅢ，EGFRvⅢ）（臨床試驗(yàn)編號(hào)NCT02209376、NCT03726515、NCT01454596）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）（NCT01109095）、白介素-13受 體α2（interleukin-13 receptorα2，IL13Rα2）（NCT04003649、NCT02208362）、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase-inducible factor，EMMPRIN）（NCT04045847）、自然殺傷細(xì)胞家族2成員D（nature killer group 2 member D，NKG2D）（NCT04270461）以及B7同系物3（B7 homolog 3，B7-H3）（NCT04385173、NCT04077866）。

1.2 新抗原的發(fā)現(xiàn)

除上述已被應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的特異性抗原外，近期也有一些新的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤特有的抗原被研究者們發(fā)現(xiàn)，其中包括Advillin（AVIL）。AVIL已被證實(shí)為一種新的癌基因［3］。在臨床上，AVIL的高表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)［3］。因此，AVIL可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新靶標(biāo)。

1.3 其他突破性的進(jìn)展

近期，有研究者打破了靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞本身的特異性抗原這一固有思路，提高了CAR-T細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。研究者［4］使用切除自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的腫瘤樣本進(jìn)行體外試驗(yàn)，證明氯毒素（chlorotoxin，CLTX）可與多種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞結(jié)合，結(jié)合率大于80%，遠(yuǎn)高于使用CAR-T療法治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤時(shí)與常用靶點(diǎn)IL13Rα2、HER-2和EGFR的結(jié)合率。通過修飾CAR-T的結(jié)構(gòu)，能夠使CLTX作為與腫瘤細(xì)胞靶向結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，顯著提高CAR-T療法對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的靶向性、選擇性和治療的安全性［4］。

2 應(yīng)用CAR-T療法治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的挑戰(zhàn)

2.1 腫瘤異質(zhì)性與脫靶效應(yīng)

腫瘤的異質(zhì)性指腫瘤子代細(xì)胞彼此之間發(fā)生改變，尤其是在生長(zhǎng)速度、侵襲性、藥物敏感性等方面。同一個(gè)體不同腫瘤的活檢和同一腫瘤的活檢都會(huì)顯示出腫瘤的異質(zhì)性。在疾病過程中，隨著時(shí)間的推移，腫瘤會(huì)發(fā)生演變。例如，針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的CAR-T靶點(diǎn)IL-13Rα2和EGFRvⅢ，在不同患者間和同一患者中都出現(xiàn)了在空間和時(shí)間上的異質(zhì)性［5-7］。這被認(rèn)為是治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤時(shí)產(chǎn)生耐藥性的根本原因。

而脫靶效應(yīng)是指由于靶點(diǎn)的特異性和覆蓋率不夠高，CAR-T不僅能識(shí)別腫瘤細(xì)胞，也能識(shí)別正常組織細(xì)胞上與腫瘤細(xì)胞共有的抗原，從而對(duì)人體正常組織器官進(jìn)行攻擊的現(xiàn)象。因此，需要尋找那些能夠高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，低表達(dá)于正常組織細(xì)胞表面的抗原，使得CART療法安全地靶向腫瘤組織。

2.2 低歸巢率與浸潤(rùn)率

CAR-T療法需要CAR-T從外周血液遷移至病灶部位對(duì)腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用，而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中此過程效率很低。原因可能是：①缺乏有利的趨化因子濃度梯度，T細(xì)胞的遷移受到限制。②腫瘤組織特殊的結(jié)構(gòu)，如腫瘤血管、抑制性的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）等，可能會(huì)影響CAR-T在病灶中的浸潤(rùn)?？茖W(xué)家們不斷探究T細(xì)胞攻擊間質(zhì)豐富的腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮作用的方法。Milner團(tuán)隊(duì)［8］發(fā)現(xiàn)，調(diào)控組織常駐CD8+記憶T細(xì)胞（tissue-resident memory CD8+T cell，TRM）組織停留特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx3具有驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞從淋巴組織中離開并聚集在腫瘤組織中的作用。而Caruana團(tuán)隊(duì)［9］已證明，對(duì)CAR-T進(jìn)行加工使其表達(dá)乙酰肝素酶可以促進(jìn)T細(xì)胞的浸潤(rùn)和抗腫瘤活性。

2.3 抑制性的TME

TME在腫瘤的發(fā)展和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，理解腫瘤細(xì)胞在TME中如何與其他細(xì)胞進(jìn)行相互作用并完成免疫逃逸是攻克腫瘤的重要一步。

TME的免疫抑制主要表現(xiàn)在：基質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子、抑制性調(diào)節(jié)細(xì)胞等影響CAR-T抗腫瘤效應(yīng)；營(yíng)養(yǎng)的缺乏和分解代謝產(chǎn)物的存在損害了T細(xì)胞的持久性和效應(yīng)功能等。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)主要包括前列腺素E2（prostaglandin E 2，PGE2）、IL-6、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）［10］。在炎癥環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞還經(jīng)常上調(diào)配體，如程序性細(xì)胞死亡配體-1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）、T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子-3（T-cell immunoglobulin and mucin-domain molecule 3，TIM-3）配體之一galetin-9和人凋亡相關(guān)因子配體（ligand of factor associated suicide，F(xiàn)asL）等。這些配體可以結(jié)合T細(xì)胞上的抑制性受體［11］，誘導(dǎo)T細(xì)胞的衰竭。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的病灶中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）占浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的30%［12］。除了Tregs，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中也很常見，并起到支持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［13］。特別是M2型巨噬細(xì)胞可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)［14］和刺激膠質(zhì)瘤干細(xì)胞［15］等的方式在免疫抑制和腫瘤支持中發(fā)揮一定作用。

2.4 其他

細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）是由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)，癥狀通常包括發(fā)熱、心動(dòng)過速、肌肉疼痛和低血壓，隨后出現(xiàn)心血管、呼吸、神經(jīng)、肝臟和腎臟等器官系統(tǒng)的功能障礙［16］。CRS并非只在CAR-T療法中出現(xiàn)，但CRS的發(fā)生是CAR-T在腫瘤病灶中活躍表現(xiàn)的結(jié)果［17］。在一些復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的外周血中注入單劑量的EGFRvⅢ靶向的CAR-T后，患者出現(xiàn)了發(fā)熱、低血壓和炎癥因子數(shù)量的升高［18］。

腫瘤溶解綜合征（tumor lysis syndrome，TLS）是指治療后大量癌細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)死亡，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到血液后導(dǎo)致多種代謝障礙的一種腫瘤急癥。當(dāng)癌細(xì)胞在體內(nèi)迅速分解時(shí)，尿酸、鉀和磷的水平上升得比腎臟清除它們的速度還快，超過了肝臟代謝和腎臟排泄的能力，這會(huì)導(dǎo)致TLS。當(dāng)代謝產(chǎn)物聚集進(jìn)而引發(fā)例如高尿酸血癥、代謝性酸中毒等代謝紊亂，這會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失?；蚣毙阅I功能衰竭，危及生命［19］。

CAR-T治療過程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)毒性癥狀，可單獨(dú)存在或伴隨CRS，是一種獨(dú)特的毒性反應(yīng)；患者可能會(huì)出現(xiàn)混亂、譫妄、失語、肥胖、肌陣攣等癥狀［20］。神經(jīng)毒性癥狀的發(fā)作是在CAR-T輸注后5～7 d，通常是在CRS期間或CRS已經(jīng)解決后，神經(jīng)毒性癥狀的嚴(yán)重程度與CRS的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，但有些患者在輕度CRS發(fā)作后才出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)毒性反應(yīng)［21］。

盡管CAR-T療法的前期療效很好，但是一些患者仍會(huì)有病灶復(fù)發(fā)，可能的機(jī)制包括：腫瘤細(xì)胞可以通過胞啃作用（trogocytosis）將目標(biāo)抗原轉(zhuǎn)移至CAR-T，在免疫逃逸的同時(shí)引起CAR-T的自相殘殺［22］；T細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在腫瘤抗原下將進(jìn)入耗竭狀態(tài)，耗竭的T細(xì)胞功能低下并持續(xù)高表達(dá)免疫抑制性受體，而Nr4a轉(zhuǎn)錄因子家族（Nr4a family of transcription factors，Nr4a-TFs）是T細(xì)胞低反應(yīng)性細(xì)胞內(nèi)程序的主要參與者，將會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞無法殺滅腫瘤細(xì)胞［23］。

3 CAR-T治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的改進(jìn)措施

3.1 新靶點(diǎn)的尋找

脫靶效應(yīng)是CAR-T毒性的重要來源。因此，尋找特異性與結(jié)合力更強(qiáng)的靶點(diǎn)從理論上可以有效降低CAR-T療法的毒性反應(yīng)。文中已列舉了一些已經(jīng)取得進(jìn)展和正在臨床試驗(yàn)中的特異性靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的CAR-T療法。另外，靶向腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）的CART研究也是一大熱點(diǎn)。靶向CSC標(biāo)志物上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的CAR-T也在Ⅰ期試驗(yàn)中被應(yīng)用于各種類型的癌癥。

針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）靶點(diǎn)的研究也是一大熱門。有些研究者嘗試研制靶向腫瘤血管的CAR-T，以抑制腫瘤血管的生成并避開TME的免疫抑制作用。其中，Santoro等［24］靶向前列腺特異性膜抗原（prostatespecific membraneantigen，PSMA）的嘗試獲得了一定成功。Deng等［25］的研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物康普瑞汀磷酸鈉（combretastatin A-4 disodium phosphate，CA4P）也可以有效增加CAR-T在實(shí)體腫瘤中的浸潤(rùn)。

此外，由于腫瘤具有異質(zhì)性，僅針對(duì)已知的幾個(gè)有限的腫瘤特異性抗原靶點(diǎn)用藥，易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。解決此類問題最有力的方法還是通過單細(xì)胞測(cè)序找到更多的腫瘤特異性靶點(diǎn)，從而避免耐藥與脫靶效應(yīng)。

3.2 組合靶點(diǎn)的應(yīng)用

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表面抗原的異質(zhì)性與正常組織細(xì)胞表面少量表達(dá)的TAA嚴(yán)重制約了CAR-T療法的有效性與安全性，而組合靶點(diǎn)（combinatorial-targeting）的應(yīng)用則提供了一個(gè)全新的思路。可以借用布爾電路中的“或（OR）”門和“與（AND）”門理解這種方法［26］?！盎颉遍T型的CAR-T可以靶向2種或以上的靶點(diǎn)。來自任一抗原的信號(hào)都可以起到激活作用，因此這種CAR-T在面對(duì)具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞時(shí)也能發(fā)揮較好的效果。Hedge等［27］設(shè)計(jì)了一種HER-2/IL13Rα2串聯(lián)的CAR，用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。他們發(fā)現(xiàn)在單一抗原刺激下，HER-2/IL13Rα2串聯(lián)CAR的激活特性與相應(yīng)的單抗原特異性CAR的激活特性相當(dāng)。但是當(dāng)腫瘤同時(shí)表達(dá)上述2種TAA時(shí)，可以觀察到2個(gè)靶信號(hào)對(duì)T細(xì)胞活化的協(xié)同作用。與單抗原特異性CAR-T相比，串聯(lián)抗原受體CAR在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型中更能延緩腫瘤生長(zhǎng)，減少抗原逃逸，提高生存率?！芭c”門型CAR-T也值得重視。這種CAR-T只有在同時(shí)受到2種或以上的抗原刺激時(shí)才能完全活化，可以有效提高CAR-T的特異性，減少對(duì)健康組織的損傷。

3.3 免疫抑制微環(huán)境的解除

解除TME對(duì)CAR-T的限制作用是本領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。除了增強(qiáng)CAR-T對(duì)TME的抵抗作用，尚有直接針對(duì)TME組成成分的一些嘗試。CAR-T必須穿過由腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF）等基質(zhì)成分構(gòu)成的物理屏障才能發(fā)揮對(duì)實(shí)體腫瘤癌細(xì)胞的殺傷作用。因此針對(duì)CAF表面特定抗原的CAR-T可能對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有著更好的治療效果。

近年來也有針對(duì)腫瘤基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）的嘗試。正常情況下，活化的T細(xì)胞自身可以表達(dá)足量的肝素酶（heparase），用于分解細(xì)胞外基質(zhì)，以便浸潤(rùn)組織。但目前CAR-T特殊的體外制備流程致使其肝素酶表達(dá)量下降，分解胞外基質(zhì)的能力也因此受限。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤異種移植模型中，肝素酶在CAR-T中的表達(dá)顯著提高了腫瘤浸潤(rùn)率和抗腫瘤活性［28］，證明這是一種改善CAR-T療法治療富含基質(zhì)的腫瘤的潛在方法。

針對(duì)TME中細(xì)胞因子的療法探究其實(shí)是目前更為主流的思路。這一策略在一種使用抗PSMA的CAR臨床前試驗(yàn)中得到證實(shí)［29］。在PSMA與顯性抑制的TGF-β受體共同表達(dá)的CAR-T上，增殖、細(xì)胞因子分泌、抗耗竭、持久性和抗腫瘤作用都有增強(qiáng)。

在針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的思路中，Liu等［30］嘗試賦予CAR-T額外的PD-1-CD28嵌合受體，從而使PD-L1轉(zhuǎn)而對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行共刺激和激活。在所有模型中，這一新增受體顯著增強(qiáng)了CAR-T的細(xì)胞功能。

3.4 聯(lián)合療法的探索

在眾多減緩T細(xì)胞耗竭的嘗試中，聯(lián)合療法有著較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。作為2種在機(jī)制上互補(bǔ)的療法，很多研究證明CAR-T療法與免疫檢查點(diǎn)療法（immunecheckpoint therapy，ICT）的聯(lián)合應(yīng)用具有相當(dāng)?shù)臐摿Α?/p>

亦有聯(lián)合CAR-T療法與溶瘤病毒療法的嘗試。Li等［31］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，rAd.sT（一種靶向TGF-β通路的溶瘤病毒）增強(qiáng)了meso-CAR-T（一種靶向間皮素，即mesothelin的CAR-T）在MDA-MB231異種移植乳腺癌小鼠模型中的療效。此外他們還發(fā)現(xiàn)此種方法尚能改善TME，增加TME中的IL-6與IL-12的水平。

CAR-T療法與放射療法也可能形成協(xié)同關(guān)系。Jin等［32］研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射能夠增加多種腫瘤組織內(nèi)IL-8的分泌。因此，可以利用這一特性，增強(qiáng)8R70 CAR-T（靶向IL-8的CAR-T）向腫瘤區(qū)域的聚集，從而提升CAR-T療法的效果。

3.5 輸注途徑的優(yōu)化

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與淋巴瘤最大的區(qū)別就是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有著明確的實(shí)體病灶，而淋巴瘤的癌細(xì)胞全身散在分布。在白血病的治療中，CAR-T療法的效果并不受淋巴細(xì)胞歸巢率的影響。但在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療中，受血腦屏障與TME的雙重限制，若使用傳統(tǒng)的全身輸注途徑，注入體內(nèi)的絕大部分CAR-T都難以歸巢至患處，療效將會(huì)大打折扣。

局部給藥可以有效避免淋巴細(xì)胞歸巢帶來的不利影響。通過局部注射或外科手段，將CAR-T直接投放至患處。局部富集的CAR-T在提升整體殺傷力的同時(shí)，又節(jié)省了CAR-T參與淋巴循環(huán)的時(shí)間，起效更快。CAR-T療法效果的提高也意味著用藥量的減少，更可以避免出現(xiàn)CAR-T引起的全身不良反應(yīng)。

由于局部直接輸注CAR-T可能引發(fā)其他的安全性問題（如TLS），因此可以利用趨化作用提高CAR-T的歸巢率。Craddock等［33］的研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤異種移植模型中，CCR2b基因在GD2型CAR-T上的表達(dá)改善了CAR-T的趨化動(dòng)力學(xué)和抗腫瘤表現(xiàn)。構(gòu)建小分子藥物受體-趨化因子胞內(nèi)段CAR，在患處局部注射該小分子藥物，使CAR-T在趨化作用下沿濃度梯度向腫瘤遷移，可能是一種較為溫和的提高CAR-T歸巢率的方法。

3.6 CRS的預(yù)防

目前，大多數(shù)CRS的毒性可以通過大劑量類固醇、血管收縮藥、通氣支持和支持性護(hù)理來控制。未來想要進(jìn)一步降低CAR-T療法并發(fā)CRS的風(fēng)險(xiǎn)，關(guān)鍵還在于提高CAR-T的組織特異性。只有CAR-T的組織特異性提高了，臨床用藥量才能夠在此基礎(chǔ)上降低，進(jìn)而從根本上提高CAR-T療法治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的安全性。

針對(duì)其他類型腫瘤CAR-T療法中的毒性反應(yīng)，目前的確有一些比較有前景的控制方法。Giordano-Attianese等［34］利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)了可化學(xué)破環(huán)的異二聚體（chemically disruptable heterodimer，CDH）與用于裂解CDH的小分子化合物。CDH作為一個(gè)亞基表達(dá)于CAR上，在聚合狀態(tài)下對(duì)CAR-T活性無實(shí)質(zhì)性影響，但當(dāng)小分子調(diào)控物進(jìn)入胞內(nèi)時(shí)則會(huì)裂解CDH，使CAR失活。未來在治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤時(shí)，在CAR-T療法取得穩(wěn)定療效后，這些新技術(shù)也可以被用來提高CAR-T的安全性，從而預(yù)防CRS與更廣泛的毒性反應(yīng)。

4 結(jié)語

由于血腦屏障的存在以及極高的復(fù)發(fā)率，傳統(tǒng)的治療方法在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用局限性較大。CAR-T療法還需要許多重大的突破性研究，但其具有的優(yōu)勢(shì)可能會(huì)成為實(shí)體瘤治療的一個(gè)重要的發(fā)展方向。

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