甲基苯丙胺使用和成癮的表觀遺傳研究進展

成英杰，孫倩倩，趙 敏

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心物質(zhì)依賴與成癮科，上海 200030

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）是一種苯丙胺類興奮劑（amphetamine-type stimulants，ATS），近年來已成為我國濫用人數(shù)最多的合成毒品之一。長期使用METH會導(dǎo)致成癮，造成精神障礙和認知損害［1］。藥物成癮是一種慢性復(fù)發(fā)性腦疾病，與遺傳、神經(jīng)發(fā)育和社會心理等因素密切相關(guān)。成癮物質(zhì)會引起多個腦區(qū)神經(jīng)環(huán)路的可塑性改變，伴隨腦功能包括獎賞、認知和情感等的改變［2］。

表觀遺傳學(xué)的概念，最初用來描述相同基因組背景下的表型變化［3］。現(xiàn)在通常指在DNA序列不發(fā)生變化的前提下，基因表達改變而產(chǎn)生的可以遺傳的表型［4］。表觀遺傳主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化和非編碼RNA等，可能參與調(diào)控神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶等過程。目前的研究認為表觀遺傳與神經(jīng)精神疾病的發(fā)生密切相關(guān)，包括阿爾茨海默病、抑郁癥、精神分裂癥和物質(zhì)成癮等［5-6］。本文對METH成癮的表觀遺傳研究進行綜述。

1 組蛋白修飾

真核細胞染色質(zhì)的基本亞單位是核小體。核小體由長約146 bp的DNA纏繞在由組蛋白組成的八聚體（組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2個）上形成［7］。組蛋白尾部的氨基酸殘基是發(fā)生修飾的主要部位，包括甲基化、乙?；?、磷酸化和泛素化等。成癮相關(guān)組蛋白修飾研究較多的是組蛋白乙?；图谆?。

1.1 組蛋白乙酰化

組蛋白乙?；亲畛Ｒ姷囊环N修飾形式，主要發(fā)生在組蛋白H3和H4的賴氨酸殘基上。組蛋白乙?；瘯菇M蛋白與DNA解離，轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合從而激活轉(zhuǎn)錄，去乙酰化則會抑制轉(zhuǎn)錄。兩者的動態(tài)平衡受到組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）的共同調(diào)控［8］。

METH可以通過影響HDACs，改變腦內(nèi)的組蛋白乙酰化。單次給藥后大鼠伏隔核內(nèi)HDAC1水平降低，引起組蛋白H4賴氨酸5位（H4K5）和8位（H4K8）乙?；黾?。HDAC2表達增加，導(dǎo)致H3K9、H3K18和H4K16乙酰化減少［9］。同時，H4乙?；脑黾涌赡芘cMETH誘導(dǎo)的基因表達增加有關(guān)，包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin-releasing factor，Crf），膽 囊 收 縮 素（cholecystokinin，Cck）以及立早基因c-fos，fos-b和c-jun等。METH誘導(dǎo)的Hdac變化還存在時間效應(yīng)和腦區(qū)特異性。單次用藥后大鼠前額葉皮質(zhì)（prefrontal cortex，PFC）中Hdac1和Hdac2減少，長期使用下Hdac2和Hdac4減少。戒斷期Hdac2水平恢復(fù)正常，而Hdac4和Hdac5表達下降［10］。伏隔核中的變化有所不同，單次給藥導(dǎo)致Hdac1減少，但Hdac2表達增加［9］。這些結(jié)果提示，在METH成癮的過程中，METH可能影響不同的Hdac表達。這可能與不同Hdac的結(jié)合位點和調(diào)控作用存在差異有關(guān)，需要進一步研究明確。

METH引起的H4去乙?；赡芘c谷氨酸受體改變有關(guān)［11］。長期濫用METH的大鼠紋狀體內(nèi)，甲基CpG結(jié)合蛋白2（methyl-CpG binding，MeCP2）、REST輔助抑制因子（REST corepressor，CoREST）和HDAC2共同形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，導(dǎo)致α-氨基羥甲基異唑丙酸（AMPA）受體亞單位谷氨酸受體1（glutamate ionotropic receptor AMPAα1，GluA1）和GluA2增強子或啟動子上的H4K5、K12和K16低乙酰化，GluA1和GluA2表達減少。MeCP2、HDAC1和轉(zhuǎn)錄抑制因子（RE1 silencing transcription factor，REST）結(jié)合，N-甲基-D-門冬氨酸（NMDA）受體亞單位谷氨酸受體1（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 1，GluN1）啟動子H4乙?；浇档停珿luN1表達減少。HDAC抑制劑丙戊酸（valproate，VPA）可以抑制HDAC1和HDAC2，阻斷METH誘導(dǎo)的H4去乙?；凸劝彼崾荏w減少。因而，HDAC抑制劑（HDAC inhibitor，HDACi）可能對METH引起的谷氨酸受體表達異常及精神癥狀有一定治療作用。

研究表明HDACi可以影響METH成癮行為，但是目前的研究結(jié)果并不一致［12］。VPA與METH聯(lián)用可以抑制METH誘發(fā)的行為敏化［13-14］；而丁酸鈉（sodium butyrate，NaB）會促進METH誘導(dǎo)的活動增多［15］。NaB還可以促進METH誘導(dǎo)條件性位置偏愛（conditioned place preference，CPP）的建立，消退期間使用NaB會促進CPP消退及阻止CPP恢復(fù)［16］。研究結(jié)果的差異可能與2個因素有關(guān)：一方面，VPA和NaB都是非選擇性HDACi，抑制的HDAC并不相同；另一方面，一些HDACi可能還有其他作用，例如VPA可以增強γ氨基丁酸能神經(jīng)傳遞［13］。HDACi對METH成癮行為的作用及其作用方式，還需要進一步研究闡明。

1.2 組蛋白甲基化

組蛋白甲基化可以發(fā)生在很多堿性殘基上，主要包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。相比乙酰化，組蛋白甲基化對基因表達的調(diào)控作用更為復(fù)雜，既有激活轉(zhuǎn)錄又有抑制轉(zhuǎn)錄的甲基化，主要取決于甲基化位點和甲基的數(shù)目［17］。例如，H3K4與轉(zhuǎn)錄激活高度相關(guān)，而H3K9和K27通常起抑制作用。組蛋白甲基化也是一個可逆的過程，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶共同調(diào)控［7］。目前，對于METH成癮中組蛋白甲基化的研究比較有限。戒斷早期，大鼠紋狀體內(nèi)組蛋白H3賴氨酸4位三甲基化（H3K4me3）顯著增加，然后逐漸下降，在戒斷1個月左右恢復(fù)正常水平［18］。H3K4me3通常促進轉(zhuǎn)錄，在METH誘導(dǎo)的行為敏化和CPP中可能有重要作用［19-20］。間斷性給藥的小鼠邊緣前腦中CC趨化因子受體2（C-C chemokine receptor 2，Ccr2）啟動子上H3K4me3顯著增加，Ccr2表達水平升高，進而促進METH誘導(dǎo)的行為敏化［20］。在CPP的建立階段，METH改變了大鼠伏隔核內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶［lysine（K）-specific methyltransferase 2A，Mll1］和去甲基酶［lysine（K）-specific demethylase 5C，Kdm5c］的表達，導(dǎo)致催產(chǎn)素受體（oxytocin receptor，Oxtr）和Fos啟動子上的H3K4me3增加，Oxtr和Fos表達上調(diào)。降低Mll1的表達可以減少H3K4me3及基因表達，破壞成癮記憶，抑制Kdm5c則有相反的作用［19］。這些研究提示，H3K4me3可能參與METH誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化和成癮行為，而其他位點的組蛋白甲基化在METH成癮中的作用尚不明確。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC），主要是在富含CG的區(qū)域，即CpG島［21］。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化的，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b等［22］。通過招募轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體或者阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，DNA甲基化可以抑制基因轉(zhuǎn)錄［23］。

METH會影響腦內(nèi)DNMTs的表達，導(dǎo)致多個腦區(qū)的DNA甲基化發(fā)生改變，包括前額葉、伏隔核、紋狀體、海馬和黑質(zhì)等［24-27］。DNA甲基化可能參與METH誘導(dǎo)的基因表達變化，如小鼠額葉中的細胞骨架活性調(diào)節(jié)蛋白（activity regulated cytoskeletal-associated protein，Arc）和Fos，以及海馬中的Kruppel樣因子（kruppel-like factor 10，Klf10）和Nr4a1［28-29］。另外，METH誘導(dǎo)大鼠PFC中的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子增加，可能與CpG島DNA甲基化減少有關(guān)［26］。

部分基因的DNA甲基化改變可能與METH誘導(dǎo)的行為異常和認知障礙密切相關(guān)。濫用METH的大鼠紋狀體和黑質(zhì)內(nèi)突觸核蛋白α（synuclein alpha，Snca）啟動子的MeCP2和DNMT1減少，DNA甲基化水平下降，Snca編碼的突觸核蛋白α顯著增加［25，30］。紋狀體中，這種改變可以持續(xù)到戒斷后21 d［25］。突觸核蛋白α表達增強與帕金森病患者的神經(jīng)元丟失和運動障礙有關(guān)，因而可能與METH濫用增加患帕金森病的風(fēng)險有關(guān)［31-32］。METH還會引起小鼠認知記憶受損和空間記憶增強，可能與PFC和海馬中突觸素（synaptophysin，Syn）的變化有關(guān)［27］。Syn編碼突觸素蛋白，主要調(diào)節(jié)突觸形成和長時程增強，其缺失會導(dǎo)致認知障礙。PFC中，METH誘導(dǎo)DNMTs和MeCP2增加，導(dǎo)致Syn啟動子DNA甲基化水平升高，Syn表達下調(diào)。海馬中的變化則與PFC相反。催產(chǎn)素（oxytocin，OT）可以使DNMTs和MeCP2恢復(fù)正常水平，維持Syn穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，阻斷METH引起的認知功能改變。另外，有研究［33］指出OT還可以抑制METH誘導(dǎo)的CPP建立和恢復(fù)，促進CPP消退。這些結(jié)果表明，OT可能是治療METH誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶損傷的候選藥物。

目前，大多數(shù)研究認為METH是通過改變DNMTs影響DNA甲基化水平的。但是，有研究［34］發(fā)現(xiàn)METH還可以減少DNA羥甲基化，使得DNA甲基化水平相對升高。這可能是通過增加10-11易位蛋白（ten-eleven translocation，TET）引起的。TET抑制劑可以阻止DNA羥甲基化，抑制METH激活的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。成癮與未成癮大鼠的伏隔核中羥甲基化峰有顯著差異，主要發(fā)生在一些鉀通道編碼基因上。同時，未成癮組大鼠伏隔核中鉀通道基因和蛋白表達增加［35］。對DNA甲基化和羥甲基化水平進行單獨檢測，可能有助于進一步闡明兩者在METH成癮中的作用。

3非編碼RNA

人類基因組的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本不編碼蛋白質(zhì)，通常被稱為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）［36］。近些年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ncRNA參與多種生物學(xué)過程，在正常發(fā)育和多種疾病中都有重要的調(diào)節(jié)作用［37］。根據(jù)其生物學(xué)功能，ncRNA可以分為2類——管家型和調(diào)節(jié)型。管家型ncRNA在細胞中廣泛表達，負責(zé)調(diào)節(jié)細胞的一般功能，包括核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）等。調(diào)節(jié)型RNA在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮著調(diào)控基因表達的重要作用，包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）等［38］。

3.1 miRNA

在ncRNA中，miRNA是研究得最多的。miRNA含22～23個核苷酸（nulceotide，nt），通常與靶mRNA的3′端種子區(qū)互補配對，降解mRNA或抑制翻譯，從而沉默基因表達［39］。METH使用可以引起嚙齒類動物腦內(nèi)miRNA的廣泛改變。METH成癮小鼠的伏隔核中45個miRNA表達改變（44個上調(diào)和1個下調(diào)），包括miR-124-3p、miR-29c-3p、miR-138等［40］。過量用藥的大鼠PFC中26個miRNA差異表達（13個上調(diào)和13個下調(diào)），包括miR-195、miR-222、miR-24等［41］。戒斷14 d的大鼠伏隔核中也檢測到了78個差異表達的miRNA（71個下調(diào)和7個上調(diào)）［42］。這些結(jié)果提示，miRNA可能參與了METH成癮的發(fā)展，持續(xù)改變的miRNA可能與成癮行為的維持有關(guān)。

部分miRNA可能會通過調(diào)控突觸可塑性介導(dǎo)METH成癮，如miR-181和miR-134。miR-181a及谷氨酸受體可能在METH成癮發(fā)展過程中有重要作用。METH濫用者外周血中miR-181a顯著降低，其調(diào)控的GluA2增加［43］。長期使用METH的大鼠伏隔核中miR-181a表達上調(diào)，可能會抑制GluA2表達并影響谷氨酸突觸傳遞［44］。而大鼠血清外泌體中miR-181a-5p的增加，可能與METH的獎賞效應(yīng)和CPP形成有關(guān)［45］。METH成癮行為的維持可能與miR-134及LIM激酶1（LIM domain kinase 1，Limk1）的作用有關(guān)。過量使用METH的大鼠背側(cè)紋狀體中miR-134增加，進而抑制Limk1表達，參與調(diào)控突觸可塑性［46-47］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，降低miR-134的表達可以減少大鼠的覓藥行為和METH的使用量。因而，抑制miR-181和miR-134可能會對METH的戒斷和預(yù)防復(fù)吸有一定作用。

miRNA可以靶向調(diào)控炎癥因子和凋亡相關(guān)基因，可能與METH引起的神經(jīng)毒性有關(guān)。用METH處理小鼠小膠質(zhì)細胞后，早期miR-143表達減少，凋亡調(diào)控基因（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）的蛋白表達增加，進而激活炎癥小體（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3），導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞活化［48］。METH持續(xù)作用下，miR-143作用于促凋亡基因（BCL2 binding component，Bbc3），通過對凋亡和自噬的雙重調(diào)控，參與METH誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞死亡過程［49］。在小膠質(zhì)細胞中過表達miR-142a-3p和miR-155-5p可以作用于泛素連接酶基因（pellino1，Peli1），阻止p38/MAPK、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路及白介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNFα）的激活，從而抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生［50］。因而，這些炎癥相關(guān)miRNA可能是METH誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵因子，可以作為METH神經(jīng)毒性的標志物和治療靶點。

血液中的部分miRNA可以穩(wěn)定存在，作為疾病診斷和預(yù)后評估的生物標志物［39］。在METH成癮中，關(guān)于濫用者血漿miRNA表達譜的研究并不多。Zhao等［51］利用微陣列對METH濫用者外周血單核細胞進行篩選后，發(fā)現(xiàn)4個miRNA表達顯著降低，包括miR-181a、miR-15b、miR-let-7e、miR-let-7d等，且其表達水平與用藥次數(shù)呈負相關(guān)。Gu等［52］也發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，METH濫用者的血清中有109個miRNA發(fā)生顯著變化，包括miR-496-3p、miR-194-5p、miR-200b-3p和miR-181a-5p等。這些循環(huán)中改變的miRNA有望作為成癮新的外周標志物，但是向臨床轉(zhuǎn)化還需要進一步研究。

3.2 其他ncRNA

lncRNA是長度超過200 nt的ncRNA，是迄今為止人類基因組中注釋的最大一類ncRNA［53］。雖然大多數(shù)lncRNA的功能尚不清楚，但是已經(jīng)有很多研究表明lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達［54］。高通量測序發(fā)現(xiàn)，METH誘導(dǎo)小鼠運動敏化和成癮的同時，伏隔核內(nèi)大量lncRNA的表達都有顯著改變并且下調(diào)的lncRNA居多［55］。在體外實驗中也發(fā)現(xiàn)METH處理的神經(jīng)元中多個lncRNA發(fā)生改變，可能與METH誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡有關(guān)［56］。另外，lncRNA Gomafu［又稱為Miat（myocardial infarction associated transcript）］敲除后小鼠對METH的反應(yīng)有所增強，可能與伏隔核內(nèi)多巴胺釋放增多有關(guān)［57］。

circRNA是一類獨特的內(nèi)源性ncRNA，呈閉環(huán)結(jié)構(gòu)，100～10 000 nt。circRNA在發(fā)育過程中的各種組織都有不同程度的表達，尤其是大腦。因而，circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展中可能有重要的作用［58］。到目前為止，與METH相關(guān)的circRNA研究比較少。Li等［59］在體外實驗中發(fā)現(xiàn)了119個表達上調(diào)和44個下調(diào)的circRNA，并且通過小鼠CPP實驗驗證了circHomer1可能與METH成癮有關(guān)。另外，敲除circHomer1還可以通過抑制Bbc3的表達，減輕METH誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷。

4 小結(jié)與展望

METH使用會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表觀遺傳變化，包括組蛋白修飾、DNA甲基化、非編碼RNA改變等。表觀遺傳可以調(diào)控基因表達，引起獎賞環(huán)路的適應(yīng)性改變，促進成癮行為的發(fā)展。表觀遺傳修飾酶可能是治療成癮的潛在靶點，如HDACs和DNMTs。外周的miRNA可以作為成癮的生物標志物。但是，目前的研究具有一定局限性。首先，動物研究采用的給藥方案不同，因而結(jié)論有較大差異。自我給藥是最接近人類用藥的模式，可以更好地模擬成癮的過程，獲得穩(wěn)定的實驗結(jié)果。其次，大腦不同區(qū)域的基因表達有特異性。研究不同腦區(qū)之間的差異，可以更好地理解METH成癮的發(fā)生機制。最后，基因表達是由多種表觀遺傳共同調(diào)控的。但是，大多數(shù)研究只關(guān)注一種表觀遺傳變化。高通量技術(shù)和生物信息學(xué)分析工具的發(fā)展，有助于揭示表觀遺傳與轉(zhuǎn)錄之間的調(diào)控作用。綜上所述，現(xiàn)有的研究提示表觀遺傳可能是METH成癮中基因表達和行為改變的關(guān)鍵，但是其調(diào)控過程還需要進一步研究。對METH成癮中表觀遺傳變化的研究，將有助于明確METH成癮的分子機制，為尋找新的標志物和有效的干預(yù)靶點提供理論依據(jù)。

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