環(huán)狀RNA在消化系統(tǒng)腫瘤疾病中的研究進展

林旭東，鞠少卿

(1.南通大學，江蘇 南通 2.南通大學附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，江蘇 南通 )

與傳統(tǒng)的線性RNA分子不同，環(huán)狀RNA circRNA(Circular RNAs,circRNA)是一類以共價鍵形成環(huán)形結構的非編碼RNA分子，不同于其他ncRNA，其缺少5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，并且其表達更穩(wěn)定，不易被Rnase降解。1976年研究者首次在植物類病毒中發(fā)現circRNA[1]，并發(fā)現其廣泛存在于真核細胞生物中。近年來尤其是2012年之后隨著高通量核酸測序技術的廣泛運用，許多原來未知的circRNA分子序列漸漸浮出水面。近些年來，對circRNA的研究呈現出了井噴的模式。雖然人們對于其功能并未得到真正的了解，但多項研究表明了circRNA在人類疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

1 circRNA的特征

circRNA廣泛存在于哺乳動物細胞中并由已知的蛋白質基因編碼表達，circRNA主要分為三類，分別是外顯子circRNA、內含子circRNA、以及外顯子-內含子circRNA，其主要由多個或單個外顯子組成[2]，You[3]等發(fā)現了circRNA尤其在哺乳動物大腦中含量較為豐富，其缺乏多聚腺苷酸[poly(A)]尾巴和帽子(capping)結構，circRNA定位于細胞質中并廣泛存在，與形成一般外顯子的線性和開放的5'-3'結構的傳統(tǒng)線性剪接不同，circRNAs包含共價閉合和末端缺失的環(huán)狀結構。近些年來隨著研究的不斷深入，circRNA在疾病中的作用被逐漸揭開了面紗。

2 circRNA的主要功能

circRNA大量存在于真核細胞生物體內，雖然近些年來有大量報道，但其研究一般都只停留在表面，還未真正弄清其具體機制。以下主要從充當“miRNA海綿”、與RNA結合蛋白(RBPs)結合、調節(jié)基因表達發(fā)揮生物學功能、以及編碼蛋白質這4個主要方面進行闡述。

2.1circRNAs作為miRNA“海綿”:miRNA“海綿”是circRNA研究最多的一種功能。circRNA通過競爭結合相關的miRNA，影響該miRNA對靶mRNA的作用[4]。許多circRNA具有多個miRNA的結合位點并同時調節(jié)它們，這些進化上保守的結合位點可確保與靶miRNA結合的效率。Wei[5]的研究中發(fā)現CircCDYL在肝癌患者血漿中高表達，其機制是通過海綿化MiR-892a以及MiR873-3p。

2.2circRNA通過調節(jié)基因發(fā)揮生物學功能:位于細胞核的一些circRNA存在U1 snRNA結合位點，可以形成RNA-蛋白復合物，并與啟動子區(qū)域的RNA聚合酶Ⅱ結合，順勢調控親本基因的轉錄。Zhang[6]等研究發(fā)現ci-ankrd52在細胞核中含量豐富而對microRNA靶位點的富集很少，其可以通過結合ankrd52基因轉錄的Pol Ⅱ直接調控ankrd52基因的表達，敲除該基因后可以下調其親本基因的表達。

2.3circRNA與RNA結合蛋白結合:circRNA可以和RNA結合蛋白結合來參與調控多種生物學功能，包括細胞增殖、分化、運動、調亡和衰老等。Circ_ZKSCAN1通過競爭性結合FMRP蛋白發(fā)揮其抑制肝細胞性肝癌組織的增值。Memczak[7]等研究證明了人類circRNA-ciRS-7轉錄物能與AGO蛋白(argonaute,AGO)密集結合，并形成了一大類轉錄后調控因子。

2.4circRNA參與蛋白質的翻譯:由于circRNA缺少5′的帽子結構和3′末端的poly(A)尾巴，所以一直被認為是無翻譯功能的。近年，發(fā)現一些circRNA是可以編碼蛋白質的，其原因可能是circRNA中富含甲基化修飾的腺嘌呤，而這種甲基化修飾，它可以發(fā)揮像內部核糖體進入位點序列同樣的作用，促使circRNA翻譯合成蛋白質[8]。CircPPP1R12A在結腸癌組織中的表達顯著增高，其原因可能是circPPP1R12A[15]攜帶一個開放閱讀框(ORF)，該ORF編碼一個功能蛋白circPPP1R12A-73aa。

3 circRNA在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究

近年來有關circRNA在人類疾病中的研究呈現出爆發(fā)式的增長，近年來研究發(fā)現circRNA分子與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展以及轉歸都有密切的關系，circRNA在消化系統(tǒng)腫瘤中能直接參與調節(jié)其病理的發(fā)生發(fā)展過程[9]，鑒于其特殊的結構，在血清中的存在更加穩(wěn)定，因此也更有潛力作為疾病的診斷標志物。消化系統(tǒng)分為消化道和消化腺，消化道包括口腔、咽、食道、胃、結直腸、肛門等部，其主要功能是進行食物機械性的消化，是食物暫時儲存的場所，并在其中進行消化和營養(yǎng)物質的吸收。消化腺主要包括唾液腺、肝臟和胰臟，其參與食物的化學性消化，其中含有多種消化酶，幫助食物的消化。目前我國居民病死率最高的惡性腫瘤中[10]，消化系統(tǒng)腫瘤占據著4位，它們分別是肝細胞癌、胃癌、食管癌和結直腸癌。

3.1circRNA在消化腺體腫瘤中的研究進展

3.1.1circRNA與肝細胞肝癌(HCC):肝細胞肝癌是我國十大腫瘤之一，發(fā)病率以及病死率都位居腫瘤疾病的前列。目前雖然隨著臨床技術的不斷提高，比如手術切除、移植等方法的改進，早期肝癌的治愈率和生存率得到了較大的提高，5年生存率達到了40%～70%，但由于大部分肝癌發(fā)現都到晚期，導致了這部分患者的預后較差[11]。近年來，越來越多的研究發(fā)現了circRNA在HCC的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，可以作為潛在的診斷和治療靶點。通過高通量測序以及實時熒光定量PCR等方法，越來越多的circRNA在肝細胞肝癌中的作用機制被廣泛研究。Zhang[12]等的研究發(fā)現由脂肪細胞攝取的外泌體circRNA可以促進腫瘤的生長，其主要機制是通過抑制miR-34a并激活USP7/Cyclin A2信號通路。circRNA cSMARCA5在HCC組織中表達下調，并且與侵襲性特征顯著相關，是肝癌患者肝切除術后總生存率和無復發(fā)生存率的獨立危險因素。Yao[13]闡明了circ_0001955通過海綿化miR-516a-5p來釋放TRAF6和MAPK11的表達，促進了HCC的腫瘤發(fā)生。Circ_RHOT1通過招募TIP60啟動NR2F6的表達來抑制HCC的發(fā)展和進展，提示circ_RHOT1可能成為HCC預后的潛在生物標志物。Zhang[14]等研究又發(fā)現了circ_TRIM33-12在肝細胞肝癌中表達下調且與惡性特征顯著相關，是影響HCC患者術后總生存(OS)和無復發(fā)生存(RFS)的獨立危險因素。近些年來circRNA在肝細胞肝癌中的研究日益增多，越來越多的circRNA在肝癌中的作用機制被逐漸闡述，也為尋找高敏感度和特異性的腫瘤標志物提供了越來越多的證據。

3.1.2circRNA與胰腺癌:胰腺癌具有惡性程度高、早期診斷困難、預后較差等特點，并且其遠處轉移的比例較高，達到90%[15]。2015年我國胰腺癌發(fā)病率位居第9位，死亡率達到了第6位[16]。由于胰腺癌的早期癥狀并沒有特異性，導致了很多患者就診時已到晚期，從而失去了最佳的手術機會。在胰腺癌中最多見的類型是胰腺導管腺癌(PDAC)。近年來，很多研究者設法從circRNA中尋找出較為敏感和特異的標志物。在Zhu[17]的研究發(fā)現胰腺癌組織中hsa_circ_0006215顯著上調。Li[18]研究circ-IARS表達與胰腺癌的轉移關系，發(fā)現了其與肝轉移、血管浸潤、腫瘤淋巴結轉移分期呈正相關，與術后生存時間負相關。Yang[19]等又發(fā)現了circ-LDLRAD3在胰腺癌組織以及病人血清中的表達比健康對照者更高，同時與CA19-9聯合檢測，對于胰腺癌的診斷特異性以及敏感度將顯著提高，而circ-LDLRAD3的敲除也能抑制胰腺癌的轉移，其機制是通過miR-137-3p/PTN軸的調控。胰腺癌的惡性程度極高，這些circRNA的發(fā)現有助于給胰腺癌的診斷，能提靈敏度和特異性，但其具體機制還需要進一步闡明。

3.2circRNA在消化道腫瘤中的研究進展。

3.2.1circRNA與食管癌:食管癌(ESCC)在腫瘤發(fā)病率中位居世界第八位，并且是腫瘤性疾病的第六大死因，最常見的病理類型是鱗狀細胞癌[20]。其五年生存率不足20%，也嚴重影響著患者的生存質量，為此，人們設法尋找出具有敏感性和特異性較高的腫瘤標志物。hsa_circ_0067934被發(fā)現在食管鱗狀細胞癌中高表達，并且其腫瘤細胞分化越差，其表達也就越高。Hu[21]等證明了circGSK3表達上調與ESCC患者的晚期臨床和不良預后呈正相關。檢測血漿中circGSK3表達可用于ESCC和早期ESCC診斷，曲線下面積分別為0.782和0.793，具有較高的診斷效能，可能作用一種新型的腫瘤標志物。Liu[22]的研究顯示circRNA_100367通過miR-217/Wnt3途徑增強KYSE-150R細胞的抗輻射能力。在體外，circRNA_100367沉默降低了輻射下KYSE-150R細胞的生長Wang等[23]研究發(fā)現在ESCC細胞、血漿和組織中circ-TTC17表達水平明顯升高，體外實驗表明，circ-TTC17可促進ESCC細胞的增殖和遷移。食管鱗狀細胞癌由于其惡性程度較高，病人有進行性吞咽困難等癥狀，對病人生活質量有較大的影響，而只依靠臨床常規(guī)檢查，較難在早期發(fā)現，因此尋找具有高靈敏度和特異性的標志物顯得尤為緊迫，circRNA由于其特殊的結構和廣泛的存在而得到關注，為尋找新型食管癌標志物提供了可能。

3.2.2circRNA與胃癌:胃癌(GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，其腫瘤的發(fā)病率和死亡率分別排名第五位以及第三位[24]。胃癌的發(fā)生是一種多種因素、多細胞、多階段的過程，諸如不良的飲食習慣、幽門螺桿菌感染都是導致胃癌發(fā)生的因素。近年來，研究主要集中在胃癌的診斷和預后中，一些致癌或抑癌的circRNA在胃癌中被逐步證實，其主要機制是通過海綿化microRNA(miRNA)。不同的circRNA在胃癌細胞和組織中表達有差異。CIRS-7是研究較為深入的circRNA之一，通過拮抗miR-7介導的PTEN/PI3K/AKT通路起重要作用的致癌circRNA，CIRS-7的高表達可以減少miR-7誘導的細胞凋亡。Wang[25]等研究發(fā)現circLMTK2在GC組織中表達上調，circLMTK2的高表達與不良預后相關，其機制是通過海綿化miR-150-5p，從而間接調控c-Myc表達，促進GC腫瘤發(fā)生。Huang[26]等同樣發(fā)現hsa_circ_0000745在胃癌組織中表達下調，組織分化越差，同樣在胃癌患者的血漿樣本中較健康對照組表達下調，表達水平越低，淋巴結轉移程度越高，血漿hsa_circ_0000745、癌胚抗原(CEA)聯合檢測，使AUC達到0.775，說明其聯合應用具有良好的診斷效能。由于circRNA廣泛的存在、穩(wěn)定性、保守，其作為胃癌的潛在標志物成為了可能。

3.3circRNA與結直腸癌:結直腸癌(CRC)是最常見的惡性腫瘤之一,它具有容易復發(fā)和轉移等特性，其發(fā)生是多種因素的綜合，比如年齡、肥胖、不健康的飲食、缺乏運動等。因此CRC對于人類的健康構成了較大危害?？紤]到傳統(tǒng)的治療手段的缺點，比如化療藥物的毒性以及耐受性，臨床治療的效果依然很難達到滿意。

circRNA在結直腸癌中的研究也日益增多，Shang[27]等研究揭示了環(huán)狀PACRGL通過miR-142-3p/miR-50 6-3p-TGF-β1軸促進大腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，以及對N1-N2中性粒細胞的分化，同時也揭示了circRNA_PACRGL在大腸癌細胞存活和轉移中的致癌作用。Chen[28]等在最近的研究中也發(fā)現了circRNA_CTNNA1作為miR-149-5p的海綿，在體內外均可以促進結腸癌細胞的增殖，同時也與結腸癌的進展呈正相關，過度表達也提示了circRNA_CTNNA1大腸癌細胞的G1/S期轉變，表達增高的結腸癌患者的腫瘤體積和質量顯著增加。低氧是導致很多實體腫瘤的一個方面，體外的circ-133來自于缺氧細胞，并通過作用于miR-133a/gef-H1/RhoA軸而進入常氧細胞并促進結直腸癌細胞的轉移。Xu[29]等發(fā)現了circRNA_0001178、circRNA_0000826在CRC組織中表達顯著上調。并且提示circRNA_0001178和circRNA_0000826可能作為結直腸癌肝轉移的潛在診斷生物標志物。Yuan[30]等研究發(fā)現circ_0026344表達水平與結直腸癌進展及淋巴結轉移呈負相關。circ_0026344低表達預示CRC患者預后不良，其機制可能是海綿化miR-21和miR-31，circ_0026344的表達水平與CRC組織中miR-21和miR-31的表達水平呈負相關。結直腸癌的發(fā)病率近年來有持續(xù)提高和年輕化的趨勢，circRNA的發(fā)現為結直腸癌尋找具有高靈敏度和特異性的標志物提供了可能。

4 小結與展望

近年來由于消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率比較以往有很大的增高，而由于其普遍具有高復發(fā)率易轉移等特點，其預后不甚理想，早期發(fā)現以及做出診斷就顯得尤為重要。因此需要尋找敏感性和特異性較高的腫瘤標志物。circRNA由于其結構穩(wěn)定，不易被降解，含量較高等多種因素而成為了被研究的熱門，有些文獻也報道了和傳統(tǒng)的腫瘤標志物聯合檢測能顯著提高對某一種腫瘤疾病的診斷效能。然而其應用也要依賴于細胞組織，還不能單獨應用在血清等容易獲得的臨床樣本中，并且circRNA與腫瘤的具體機制也需要進一步闡明。隨著進一步深入的研究，circRNA有望成為特異性和敏感性較高的腫瘤標志物。