實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜法快速檢測(cè)保健酒中非法添加的12種PDE5抑制劑

齊春艷 黎欣欣 張靜 雷毅

摘要：目的：建立一種實(shí)時(shí)直接分析離子源（Direct analysis in real time，DART）結(jié)合四極桿/靜電軌道離子阱高分辨質(zhì)譜法（quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，Q-Orbitrap HRMS）快速篩查保健酒中非法添加的12種PDE5抑制劑。方法：樣品經(jīng)80%乙腈水超聲提取，過0.22 μm微孔濾膜后用DART-Q-Orbitrap HRMS聯(lián)用儀測(cè)定。DART離子源的電離模式為正模式，樣品傳輸速率為0.20 mm/s，離子化溫度為400 ℃，柵極電壓為400 V。Q-Orbitrap HRMS掃描模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描（Full MS/ddMS2）。結(jié)果：在全掃描模式下測(cè)定目標(biāo)化合物的一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)，與理論精密質(zhì)量數(shù)相比，相對(duì)質(zhì)量偏差小于1.89 ppm，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定性;同時(shí)采集二級(jí)質(zhì)譜信息，進(jìn)一步提高定性準(zhǔn)確性。該方法檢出限范圍為0.03～2.50 mg/kg，滿足篩查要求。結(jié)論：該方法具有分析速度快，定性準(zhǔn)確，環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，可作為保健酒中非法添加的12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準(zhǔn)定性檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：質(zhì)譜法;保健酒;PED5抑制劑;非法添加

Rapid Detection of 12 Illegally Added PDE5 Inhibitors in Health Wine by Real-Time Direct Analysis Mass Spectrometry

QI Chunyan， LI Xinxin， ZHANG Jing， LEI Yi

（Guangdong Food Inspection Institute（Guangdong alcohol testing center）， Guangzhou 510000， China）

Abstract： Objective：To establish a real-time direct analysis in real time（DART）combined with quadrupole/Orbitrap high resolution mass spectrometry（q-orbitrap HRMS）to quickly screen 12 kinds of PDE5 inhibitors in health wine.Methods： the samples were extracted by ultrasonic with 80%acetonitrile water and passed 0.22μM microporous membrane was filtered and determined by dart-q-orbitrap HRMS.The ionization mode of dart ion source is positive mode，the sample transfer rate is 0.20 mm/s，the ionization temperature is 400 ℃，and the gate voltage is 400 V.Q-orbitrap HRMS scanning mode is full scanning/data dependent secondary scanning（full MS/ddms2）.Results： the first-order precision mass number of the target compound was determined in the full scanning mode.Compared with the theoretical precision mass number，the relative mass deviation was less than 1.89 ppm，accurate and qualitative;At the same time，the secondary mass spectrometry information is collected to further improve the qualitative accuracy.The detection limit of this method is 0.03～2.50 mg/kg，which meets the screening requirements.Conclusion： this method has the advantages of fast analysis speed，accurate qualitative and environment-friendly.It can be used as a rapid screening and accurate qualitative detection method for 12 kinds of PDE5 inhibitors illegally added in health wine.

Keywords： mass spectrometry; health wine; PED5 inhibitor; illegally added

保健酒是以白酒或其他酒類為酒基，選擇有治療作用和滋補(bǔ)性能的中藥或藥食同源物質(zhì)如人參、鹿茸、海馬、海參等，通過浸泡、浸漬、蒸餾等加工手段制成的飲料酒，具有滋補(bǔ)健體、緩解疲勞、行氣活血等保健作用[1-2]。面對(duì)巨大的市場(chǎng)需求和利益誘惑，一些不法商家為凸顯產(chǎn)品功能，吸引消費(fèi)者，在其產(chǎn)品中非法加入西地那非、伐地那非、育亨賓等PDE5抑制劑（5型磷酸二酯酶抑制劑），達(dá)到獲取暴利的目的[3]。由于非法添加存在隨意性大，劑量不明確等問題，消費(fèi)者若長(zhǎng)期、超量食用可能會(huì)引起心律失常、心肌梗塞、高血壓等不良反應(yīng)，甚至威脅生命安全[4]。

目前，PDE5抑制劑的檢測(cè)方法主要有膠體金免疫層析法（GICA）、薄層色譜法（TLC）、拉曼光譜法、近紅外光譜法（NIRS）、液相色譜法（LC）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等（LC-MS/MS）。其中，GICA法、TLC法、拉曼光譜法、NIRS法往往存在靈敏度低、選擇性差、假陽性等問題[5]。LC法和LC-MS/MS法因其高靈敏度和高選擇性，是目前常用的檢測(cè)方法。這些方法傳統(tǒng)檢測(cè)方法雖然前處理比較簡(jiǎn)單，但是往往存在分離分析時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)試劑消耗量大，環(huán)境污染大等缺點(diǎn)。

DART-Q-Orbitrap HRMS法是結(jié)合了敞開式常壓電離源和高分辨質(zhì)譜儀兩者優(yōu)勢(shì)的一種檢測(cè)技術(shù)。采用DART離子源進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，待測(cè)樣品無需冗長(zhǎng)的色譜分離過程，分析速度快，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定性分析。Q-Orbitrap HRMS結(jié)合了四級(jí)桿的高選擇性和離子阱的高靈敏度、高分辨率的優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性。

本研究采用DART-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)，建立了一種保健酒中12種PDE5抑制劑快速篩查與精準(zhǔn)定性的檢測(cè)方法。該方法具有分析速度快，有機(jī)試劑用量少、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。此外，通過一級(jí)全掃描獲得12種PDE5抑制劑的精確質(zhì)量數(shù)，根據(jù)各目標(biāo)物的提取離子圖進(jìn)行初步定性，同時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描模式獲得12種PDE5抑制劑的二級(jí)特征質(zhì)譜圖，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的精準(zhǔn)定性。本方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效地完成保健酒中12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準(zhǔn)定性，為維護(hù)保健酒行業(yè)的健康發(fā)展和保障我國(guó)食品安全提供技術(shù)

支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西地那非、紅地那非、偽伐地那非、氨基他達(dá)拉非、育亨賓（純度均≥99.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）;羥基豪莫西地那非、那紅地那非、硫代西地那非（純度均≥99.3%，加拿大TLC標(biāo)準(zhǔn)品公司）;硫代艾地那非、伐地那非（純度均≥98.6%，美國(guó)Stanford Chemicals有限公司）;他達(dá)拉非（純度為99.2%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）;去甲基他達(dá)拉非（純度為99.3%，北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）;乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）;試驗(yàn)用水為一級(jí)水（自制）;GHP針式過濾器（0.22 μm，美國(guó)波爾有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

DART實(shí)時(shí)直接分析離子源（美國(guó)Ion Sense公司）;Thermo Q-Exactive Orbitrap超高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）;電子分析天平（MS105DU、PL602E，瑞士Mettler Toledo公司）;移液器（1～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL，1.0～10 mL，德國(guó)Eppendorf公司）;EOAA-HM-01多管渦旋混合器（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（東莞科橋超聲波設(shè)備有限公司）;Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶，用乙腈溶解并定容至刻度，得濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液。貯存于2～8 ℃冰箱中。

分別準(zhǔn)確移取10 μL各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用80%乙腈水稀釋并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 儀器條件

DART離子源條件設(shè)置：電離方式為正離子模式;離子化氣體為氦氣，壓力為0.55 MPa;待機(jī)氣體為氮?dú)?，壓力?.30 MPa;進(jìn)樣模式為12-Dip-it模式;離子源出口至質(zhì)譜進(jìn)口距離為2.40 cm;樣品傳輸速率為0.20 mm/s;離子化溫度為400 ℃;柵極電壓為400 V。

Exactive條件設(shè)置：電離方式為正離子模式;離子傳輸管溫度為250 ℃;掃描方式為Full MS/ddMS2;一級(jí)掃描范圍：m/z 100～1 000;一級(jí)掃描分辨率70 000;AGC target：1e6;Maximum IT：100 ms;二級(jí)掃描分辨率：17 500;AGC target：1e5;Maximum IT：50 ms;NCE：20 eV、40 eV、60 eV。

1.3.3 前處理?xiàng)l件

準(zhǔn)確稱取混勻后的保健酒樣品1 g（精確至0.01 g）于50 mL容量瓶中，加適量80%乙腈水溶液，渦旋混勻，超聲15 min，放冷至室溫，用80%乙腈水定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，供DART-Q-Orbitrap HRMS檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品傳輸速率

本試驗(yàn)將樣品傳輸速率分別設(shè)置為0.2 mm/s、

0.3 mm/s、0.4 mm/s、0.5 mm/s和0.6 mm/s，對(duì)濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。樣品傳輸速率在0.2～0.6 mm/s范圍內(nèi)，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著樣品傳輸速率的增大逐步降低。這是因?yàn)闃悠穫鬏斔俾试酱?，目?biāo)化合物與離子化氣體接觸越不充分，離子化效率較低，離子響應(yīng)強(qiáng)度也隨之降低。因此，綜合離子響應(yīng)強(qiáng)度、峰形等因素，最終選擇樣品傳輸速率為0.2 mm/s。

2.2 離子化溫度

本試驗(yàn)以50 ℃為步長(zhǎng)，在250～550 ℃范圍內(nèi)，對(duì)濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。在250～400 ℃范圍內(nèi)，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)溫度高于400 ℃后，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著離子化溫度的升高而降低。因此，最終選擇400 ℃作為離子化溫度。

2.3 柵極電壓

本試驗(yàn)考察柵極電壓在250～500 V范圍內(nèi)，以50 V為步長(zhǎng)，對(duì)濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。在250～400 V

范圍內(nèi)，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著柵極電壓的增大而增強(qiáng);當(dāng)柵極電壓大于400 V后，離子響應(yīng)強(qiáng)度隨著柵極電壓的增大而降低。因此，最終柵極電壓選擇為400 V。

2.4 定性過程

LC-MS/MS法通常利用保留時(shí)間、離子對(duì)豐度比等信息進(jìn)行定性，而Q-Orbitrap HRMS測(cè)得的一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)即可作為定性的依據(jù)[6]。12種PDE5抑制劑的一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)理論值與試測(cè)值之間的相對(duì)質(zhì)量偏差在0.02～1.89 ppm范圍內(nèi)，均小于5.0 ppm，滿足定性需求。本研究同時(shí)采集了二級(jí)特征碎片離子信息，通過一級(jí)質(zhì)譜信息與二級(jí)特征碎片離子信息相結(jié)合的方式，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定性。12種PDE5抑制劑的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2.5 檢出限

通過在空白保健酒基質(zhì)中添加不同濃度水平的12種PED5抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定各個(gè)物質(zhì)的檢出限。如表2所示，12種PDE5抑制劑檢出限在0.03～2.50 mg/kg范圍內(nèi)，滿足篩查的需求。

2.6 市售樣品的檢測(cè)

采用本文建立的方法對(duì)市售的10批次保健酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次進(jìn)樣，采用一級(jí)提取離子圖和一級(jí)精密質(zhì)量數(shù)對(duì)樣品中可能添加的12種PDE5抑制劑進(jìn)行初步定性篩查，若出現(xiàn)可疑樣品，結(jié)合二級(jí)特征碎片離子進(jìn)行進(jìn)一步確證。篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)1批次鹿尾巴酒為西地那非陽性樣品。采用國(guó)家現(xiàn)行食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法--BJS 201805 食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定（第一法）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該批次鹿尾巴酒為西地那非陽性樣品，含量為681 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究將DART與Q-Orbitrap HRMS兩者優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，建立了一種保健酒中12種PDE5抑制劑快速篩查與精準(zhǔn)定性的檢測(cè)方法。該方法無需色譜分離過程，分析速度快，有機(jī)試劑消耗量少，綠色環(huán)保。此外，Q-Orbitrap HRMS通過一級(jí)全掃描獲得12種PDE5抑制劑的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)，同時(shí)以數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描模式獲得的二級(jí)特征質(zhì)譜信息為基礎(chǔ)，構(gòu)建了12種PDE5抑制劑質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，此數(shù)據(jù)庫(kù)作為自建數(shù)據(jù)庫(kù)可不斷擴(kuò)充，為實(shí)現(xiàn)保健酒中非法添加化學(xué)藥物的快速篩查和精準(zhǔn)定性提供數(shù)據(jù)支撐。本方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效地完成保健酒中12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準(zhǔn)定性，為維護(hù)保健酒行業(yè)的健康發(fā)展和保障我國(guó)食品安全提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1]劉正才，陳章捷，郭菁，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定保健酒中14種黃酮類成分的含量[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2020，11（7）：2178-2184.

[2]王玉潔，王倩，胡正偉，等.淺析中國(guó)保健酒市場(chǎng)的現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2019（11）：89-90.

[3]劉子雄，黃景輝，譚貴良，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中78種非法添加化學(xué)藥物[J].現(xiàn)代食品科技，2020，36（12）：283-292.

[4]孫健，胡青，張甦，等.超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中30種非法添加壯陽類化合物[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2018，37（4）：419-426.

[5]朱燕燕，馬桂娟，龔慧.HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定保健食品中11種壯陽類非法添加[J].食品工業(yè)，2020，41（1）：315-318.

[6]國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局.BJS 201805食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定[EB/OL].（2018-07-17）[2021-09-24].https：//www.doc88.com/p-7877817926821.html.