比索洛爾對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞功能及MAPK/ERK1/2信號通路的影響

馬玉茹，趙琳

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 心臟中心內(nèi)科，寧夏 銀川 750004）

心力衰竭是多種原因引起的一種心臟泵功能不全綜合征[1]。從廣義來講，心力衰竭是指在適當(dāng)?shù)幕匦难康那闆r下心排血量不能滿足機體代謝的需要[2-4]。而慢性心力衰竭是由各種原因引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，導(dǎo)致左心室充盈和左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）降低而引起的一組臨床綜合征，是各種心血管疾病發(fā)展的最終階段，也是心血管疾病死亡的主要原因[5]。研究顯示[6-7]，慢性心力衰竭患者5年生存率不足50%。所以，探討臨床治療慢性心力衰竭的有效方法成為研究的重點。目前，β 受體阻滯劑是臨床治療慢性心力衰竭的重要手段[8-9]。比索洛爾是一種β 受體阻滯劑，可以選擇性地阻斷腎上腺素與β1受體的連接來發(fā)揮作用[10]。研究顯示[11-12]，比索洛爾可顯著降低重度心力衰竭患者的病死率，但其具體的分子機制有待進一步研究。本研究旨在探討比索洛爾保護功能衰竭心肌細胞的相關(guān)機制，以期為更有效的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

8 ～10 周SPF 級雄性SD 大鼠45 只，體重（220±50）g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所[動物合格證號：0001517，實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2017-0005]，MAPK 抗體、p-MAPK 抗體、ERK1/2 抗體、p-ERK1/2 抗體購自美國Santa Cruze 公司，HE 染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，比索洛爾購自杭州民生公司（批號：T05F555）。

1.2 模型復(fù)制及分組

隨機取15 只大鼠作為對照組，隨機取50 只大鼠用于復(fù)制慢性心力衰竭模型。模型復(fù)制方法參照文獻[13]，具體方法：腹腔注射阿霉素，單次注射劑量為2.5 mg/（kg·次），2 周內(nèi)注射6 次，總注射劑量為15 mg/kg。對照組腹腔注射等量生理鹽水。阿霉素首次腹腔注射5 周后，進行超聲心動圖檢查，模型大鼠心腔擴大，左心室短軸縮短率＜30%表明模型復(fù)制成功。排除死亡大鼠，共有35 只大鼠模型復(fù)制成功。隨機選取30 只模型復(fù)制成功的大鼠分為比索洛爾組和模型組，每組15 只，剩余5 只未納入實驗組。比索洛爾組給予比索洛爾灌胃，劑量為0.9 mg/（kg·d），模型組和對照組均給予10 ml/kg 蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃35 d。同時，模型組和比索洛爾組繼續(xù)腹腔注射阿霉素，1 次/周。

1.3 心功能檢測

給藥結(jié)束后，采用超聲心動圖檢測大鼠心功能。檢查前，采用地西泮和氯胺酮進行麻醉，劑量分別為5 mg/kg 和50 mg/kg，腹腔注射。麻醉后用超高分辨率小動物超聲系統(tǒng)（VeVo）進行檢測，指標(biāo)包括左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、舒張末期左心室后壁厚度（LVPWD）、收縮末期左心室后壁厚度（LVPWS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）。

1.4 慢性心力衰竭生化指標(biāo)檢測

采集各組大鼠靜脈血4 ml，采用日立7600-020型全自動生化分析儀（日本日立公司）檢測患者的N 末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、肌紅蛋白（Mb）、心肌肌鈣蛋白（cTnI）及肌酸激酶同工酶（CK-MB），試劑盒均購自南京建成生物有限公司，按照試劑盒說明書步驟操作。

1.5 心肌組織HE 染色

實驗結(jié)束后處死大鼠，完整取下心臟組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，烤片，冷卻后低溫凍存。經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化。蘇木精染色30 ～60 s，沖洗5 min，伊紅染色30 s，沖洗5 min；乙醇梯度脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干，置光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 Western blotting 檢測MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白

收集各組的大鼠心肌組織，提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度?；旌仙蠘泳彌_液，煮沸變性，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育、ECL 法顯影定影。通過Quantity One 軟件分析條帶強度，以GAPDH 為內(nèi)參，檢測MAPK、p-MAPK、ERK1/2 及p-ERK1/2 蛋白的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠的一般情況

對照組大鼠一般狀況良好，進食、飲水及二便正常，無死亡。模型組大鼠在模型復(fù)制后，出現(xiàn)明顯精神不佳，進食、飲水量減少，活動量也減少，毛發(fā)無光澤。比索洛爾組出現(xiàn)不良癥狀的時間較模型組晚，進食量及飲水量略高于模型組。模型組、比索洛爾組大鼠體重均呈逐漸下降趨勢，但比索洛爾組大鼠體重下降較為緩慢。

2.2 3 組大鼠心臟功能的比較

3 組大鼠心臟功能各指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組大鼠的LVEDD、LVESD 較對照組變大（P＜0.05），LVPWD、LVPWS、LVEF 較對照組變薄或降低（P＜0.05）；比索洛爾組LVEDD、LVESD 較模型組變?。≒＜0.05），LVPWD、LVPWS、LVEF 較模型組增厚或升高（P＜0.05）。見表1。

2.3 3 組大鼠慢性心力衰竭生化指標(biāo)的比較

3 組大鼠的慢性心力衰竭各生化指標(biāo)的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組NT-proBNP、Mb、cTnI、CK-MB 水平較對照組升高（P＜0.05）；比索洛爾組NT-proBNP、Mb、cTnI、CK-MB 水平較模型組降低（P＜0.05）。見表2。

2.4 3 組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果

HE 染色發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠心肌細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整、無炎癥細胞浸潤。模型組及比索洛爾組大鼠心室壁顯著增厚，心腔明顯縮小，血管內(nèi)膜增厚呈明顯的纖維化，心肌細胞結(jié)構(gòu)紊亂，可見炎癥細胞浸潤。比索洛爾組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)相對完整，與模型組相比，心肌細胞水腫、壞死現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)。見圖1。

2.5 3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白表達水平的比較

3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組的MAPK/ERK 蛋白的表達水平較對照組升高（P＜0.05）；比索洛爾組的MAPK/ERK 蛋白的表達水平較模型組降低（P＜0.05）。見表3和圖2。

表1 3 組大鼠心臟功能比較 （n =15，±s）

表1 3 組大鼠心臟功能比較 （n =15，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別 LVEDD/mm LVESD/mm LVPWD/mm LVPWS/mm LVEF/%對照組 4.9±0.8 2.7±0.6 1.8±0.4 3.1±0.7 83.5±11.3模型組 9.3±0.9① 8.9±1.1① 1.4±0.5① 1.9±0.5① 34.6±3.1①比索洛爾組 5.8±0.4①② 4.6±0.4①② 1.8±0.5①② 2.6±0.5② 61.3±7.2①②F 值 9.043 14.344 17.405 18.026 17.930 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 3 組大鼠慢性心力衰竭生化指標(biāo)比較 （n =15，±s）

表2 3 組大鼠慢性心力衰竭生化指標(biāo)比較 （n =15，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別 NT-proBNP/（ng/L） Mb/（μg/L） cTnI/（μg/L） CK-MB/（u/L）對照組 0.2±0.0 40.6±2.7 0.1±0.1 0.8±0.2模型組 7.6±1.6① 145.3±13.7① 0.6±0.1① 4.5±1.5①比索洛爾組 3.0±0.8①② 82.5±5.5①② 0.2±0.0①② 2.3±0.7①②F 值 14.824 24.545 26.013 13.820 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 3 組大鼠心肌組織染色 （HE×100）

表3 3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 （n =15，±s）

表3 3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 （n =15，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別 MAPK p-MAPK ERK1/2 p-ERK1/2對照組 0.3±0.1 0.3±0.1 0.1±0.1 0.2±0.1模型組 1.0±0.2① 1.3±0.2① 0.5±0.1① 0.6±1.0①比索洛爾組 0.8±0.1①② 0.5±0.2①② 0.3±0.1①② 0.3±0.1①②F 值 12.983 9.349 14.034 10.870 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白表達

3 討論

心力衰竭是指心肌受到嚴(yán)重的傷害，無法正常地泵出足夠的血液來滿足身體各個器官活動及代謝的需求，心臟結(jié)構(gòu)逐漸肥大，并無法滿足身體組織、器官的代謝需求，是病態(tài)的生理狀況，也可能是任何心臟疾病最終的表現(xiàn)[14]。2016年版的中西醫(yī)專家共識共推薦6 類常用西藥治療心力衰竭：包括ACEI 類、β受體阻滯劑、ARA 類、利尿劑、地高辛、血管擴張劑等。螺內(nèi)酯又稱為比索洛爾，是治療心力衰竭的常用藥物之一，降低了慢性心力衰竭病死率[15-16]。本研究用大鼠復(fù)制心力衰竭模型，探討比索洛爾發(fā)揮抗心力衰竭的分子機制。

心力衰竭發(fā)生后，心肌功能受損，心臟會發(fā)生一系列結(jié)構(gòu)改變，微觀層面表現(xiàn)為心肌細胞肥厚、胞外基質(zhì)及膠原纖維網(wǎng)增生，即“心室重塑”[17-18]。心肌細胞減少使心肌整體收縮力下降；纖維化的增加又使心室順應(yīng)性下降，重塑更趨明顯，心肌收縮力不能發(fā)揮其應(yīng)有的射血效應(yīng)，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的終末階段[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，比索洛爾組LVEDD、LVESD 變小，LVPWTd、LVPWS、LVEF 增厚或升高。一些慢性心力衰竭生化指標(biāo)對判斷患者病情也有一定的指導(dǎo)意義，本研究檢測發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的慢性心力衰竭生化指標(biāo)NTproBNP、Mb、cTnI、CK-MB 水平最高，比索洛爾組次之，對照組相關(guān)指標(biāo)水平均最低。表明比索洛爾有效降低心力衰竭指標(biāo)水平，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，延緩模型大鼠心室重構(gòu)的進程。HE 染色也證實，模型組及比索洛爾組大鼠心室壁顯著增厚，心腔明顯縮小，血管內(nèi)膜增厚呈明顯的纖維化。而比索洛爾組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)相對完整，與模型組比較，心肌細胞水腫、壞死現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)。

ERK 包括ERK1 和ERK2，是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細胞核的關(guān)鍵分子[21]。許多其他信號通路明顯活化時，可活化蛋白激酶ERK 信號通路，ERK 明顯活化時，也可活化其他信號通路，從細胞外作用于細胞，至細胞出現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，通過MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的三級激酶級聯(lián)反應(yīng)[11]。在信號網(wǎng)絡(luò)中MAPK 信號傳遞途徑起著極為重要的作用，控制著細胞多種生理過程，如細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡等[23-24]，信號傳遞途徑是涉及調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育及分裂的信號網(wǎng)絡(luò)的核心[25]。在本研究中，通過Western blotting 檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組的ERK1/2 及p-MAPK蛋白表達水平升高；而與模型組比較，比索洛爾組的ERK1/2 和p-MAPK 蛋白表達水平又相對降低。表明比索洛爾可能通過抑制MAPK/ERK1/2 信號通路，降低心肌自噬活性，發(fā)揮心肌保護作用。

綜上所述，比索洛爾能通過抑制MAPK/ERK1/2 信號通路激活，發(fā)揮保護心力衰竭大鼠心肌細胞的作用。