NR2F2過(guò)表達(dá)對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響及機(jī)制研究*

張艷麗， 常文慧， 趙梓妍， 王文明， 李 菁， 丁 怡△

濰坊醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室 2應(yīng)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室 3眼科學(xué)教研室，濰坊 261053

乳腺癌(breast cancer，BC)是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[1-3]。其中三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)均表達(dá)陰性的一種乳腺癌亞型[4]，約占乳腺癌的15%～20%[5]。由于缺乏治療靶點(diǎn)，三陰性乳腺癌治療手段較為局限，預(yù)后較差[6]。因此探索潛在的分子靶基因?qū)θ幮匀橄侔┰缙谠\斷與治療有十分重大的意義。

雞卵清蛋白上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子(The chicken ovalbumin upstream promoter transcriptional factors，COUP-TFs)屬于類固醇/甲狀腺激素受體超家族[7-9]。由于其配體尚未被發(fā)現(xiàn)，所以被形象地稱為“孤兒核受體”。在脊椎動(dòng)物，已經(jīng)鑒定出2種COUP-TF，分別為COUP-TFⅠ(EAR3)[10-11]和COUP-TFⅡ(ARP-1)[12-13]，也稱為核受體2家族1和2(NR2F1和NR2F2)。近年來(lái)NR2F2被認(rèn)為是腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過(guò)程中的重要調(diào)控分子，在腫瘤發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的遷移與侵襲，以及不良的臨床預(yù)后密切相關(guān)[14]。Zhou等[15]發(fā)現(xiàn)，NR2F2敲除后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲受到抑制，組織病理檢測(cè)結(jié)果顯示NR2F2的高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。Nagasaki等[16]通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，119例乳腺癌患者中59%的人NR2F2免疫組化陽(yáng)性，且NR2F2的高表達(dá)與較差的預(yù)后和臨床結(jié)局以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，我們通過(guò)構(gòu)建NR2F2過(guò)表達(dá)4T1細(xì)胞模型，觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響及其可能的機(jī)制，為闡明NR2F2的生物學(xué)作用提供依據(jù)，為三陰性乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%的青鏈霉素的RPMI培養(yǎng)液，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的各種實(shí)驗(yàn)。小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1細(xì)胞株來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)于Hyclone公司，青霉素/鏈霉素購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。

1.2 慢病毒感染

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞消化后，以(3～5)×103/孔接種于96孔板中，第2天細(xì)胞匯合度達(dá)到約30%時(shí)，按復(fù)感染指數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=10加入NR2F2過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，然后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，10 h后更換新鮮培養(yǎng)液，72 h后在熒光顯微鏡下觀察感染的細(xì)胞，視野內(nèi)所有細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光，表示轉(zhuǎn)染病毒已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)待其穩(wěn)定生長(zhǎng)后，用5 mg/L的嘌呤霉素進(jìn)行篩選。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)感染后NR2F2的表達(dá)量。慢病毒感染試劑、嘌呤霉素由吉?jiǎng)P基因公司提供，Opti-MEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司。

1.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于提前橫向標(biāo)記好直線的6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%，更換為含1%血清的培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞12 h。之后用200 μL的槍頭在每孔中縱向劃直線，PBS漂洗以除去劃下的細(xì)胞。隨后加入無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡下觀察并拍下0、24 h劃痕愈合的照片。采用Image-Pro-Plus 6.0分析過(guò)表達(dá)NR2F2組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的遷移比例。

1.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用低濃度血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整至2.0×105/mL，上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)液。5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h后，將下室面穿過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。采用Image-Pro-Plus 6.0計(jì)數(shù)兩組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)。Transwell chamber購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel基質(zhì)膠(購(gòu)自Sigma公司)在冰上融化，在冰上按照基質(zhì)膠∶無(wú)血清培養(yǎng)液=1∶9的比例稀釋并混勻。將Transwell小室放入24孔板內(nèi)，用預(yù)冷的槍頭取50 μL基質(zhì)膠稀釋液均勻加入小室內(nèi)(避免氣泡的產(chǎn)生)，放入37℃細(xì)胞孵育箱過(guò)夜固化，使用前加入50 μL無(wú)血清培養(yǎng)液水化基底膜30 min。將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用低血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整至2.0×105/mL，上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)液。5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h后，將下室面穿過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。采用Image-Pro-Plus 6.0計(jì)數(shù)兩組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.6 Western blot檢測(cè)

提取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞蛋白，細(xì)胞用RIPA與PMSF混合液裂解，在4℃、12000 r/min離心15 min。收集上清液，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。加入一抗4℃下孵育12 h，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃下反應(yīng)1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑ECL發(fā)光并在曝光儀上進(jìn)行曝光。采用Image-Pro-Plus對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，并以目的蛋白與β-actin灰度值的比值反映目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。NR2F2抗體購(gòu)自Perseus Proteomics公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購(gòu)自CST公司，β-actin抗體購(gòu)自Proteintech公司。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)

用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用分光光度法測(cè)定其濃度和純度。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為95℃30 s，后續(xù)的40個(gè)循環(huán)為95℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 15 s。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)量，以與對(duì)照組的比值反映相對(duì)表達(dá)量。逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒由東洋坊提供。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。E-cadherin：上游5′-GCCACCGATGCAGACGATGAC-3′，下游5′-CAGCCTG-AACCACCAGAGTGTATG-3′，N-cadherin：上游5′-AGGCGTCTGTGGAGGCTTCTG-3′，下游5′-TGCCGTCCTCGTCCACCTTG-3′，Vimentin：上游5′-ACTAGCCGCAGCCTCTATTCCTC-3′，下游5′-GAAGTCCACCGAGTCTTGAAGCAG-3′，NR2F2：上游5′-GTGCCTCAAAGTGGGCATGA-3′，下游5′-ATCCGGACAGGTACGAGTGG-3′。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 5.0軟件制圖，用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同一實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。各組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NR2F2細(xì)胞株的構(gòu)建

利用體外培養(yǎng)的小鼠三陰性乳腺癌細(xì)胞系4T1，通過(guò)帶有GFP的慢病毒感染，經(jīng)嘌呤霉素篩選，構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NR2F2的4T1細(xì)胞株(OX-NR2F2-4T1)。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光，與對(duì)照細(xì)胞(NC-4T1)相比，過(guò)表達(dá)NR2F2的細(xì)胞形態(tài)上更細(xì)長(zhǎng)，呈間質(zhì)表型特征(圖1A)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)2種細(xì)胞NR2F2 mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示，OX-NR2F2-4T1細(xì)胞中NR2F2表達(dá)為NC-4T1細(xì)胞2倍多(圖1B)。Western blot檢測(cè)NR2F2蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，OX-NR2F2-4T1細(xì)胞中NR2F2表達(dá)明顯高于NC-4T1細(xì)胞(圖1C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1D)。這些均提示過(guò)表達(dá)NR2F2的4T1細(xì)胞構(gòu)建成功。

A：小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染、嘌呤霉素篩選后，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，過(guò)表達(dá)NR2F2(OX-NR2F2-4T1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)較細(xì)長(zhǎng)(×100)；B：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NR2F2 mRNA的表達(dá)，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞NR2F2 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(NC-4T1)；C：Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞NR2F2蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組；D：NR2F2蛋白表達(dá)結(jié)果分析(n=3)；與NC-4T1比較，*P<0.05 圖1 構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NR2F2乳腺癌細(xì)胞株Fig.1 Construction of a 4T1 cell strain stably over-expressing NR2F2

2.2 NR2F2對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

我們通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察了NR2F2對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，OX-NR2F2-4T1組與NC-4T1組的細(xì)胞遷移率的差異增大，至24 h時(shí)，OX-NR2F2-4T1組細(xì)胞中劃痕幾乎愈合，而在對(duì)照組中劃痕仍清晰可見(jiàn)(圖2A)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劃痕實(shí)驗(yàn)基本一致，即OX-NR2F2-4T1組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于NC-4T1組(圖2C)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(圖2D)。這提示NR2F2能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。

A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，劃痕24 h后，OX-NR2F2-4T1組遷移率比NC-4T1組的遷移率顯著增大；B：劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析(n=3)，OX-NR2F2-4T1組遷移率明顯高于NC-4T1組；C：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，接種24 h后，OX-NR2F2-4T1組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于NC-4T1組；D：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析(n=3)；與NC-4T1組比較，*P<0.05圖2 NR2F2對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響Fig.2 Effect of NR2F2 on migration ability of breast cancer cells

2.3 NR2F2對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

我們利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NR2F2對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，相比NC-4T1組細(xì)胞，OX-NR2F2-4T1組的細(xì)胞侵襲能力增加(圖3A)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)，提示NR2F2過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

A：將細(xì)胞接種預(yù)置基質(zhì)膠的Transwell小室的上室，孵育24 h后，OX-NR2F2-4T1組穿膜細(xì)胞數(shù)比NC-4T1組明顯增加；B：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析(n=3)；與NC-4T1組比較，*P<0.05圖3 NR2F2對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.3 Effect of NR2F2 on the invasion ability of breast cancer cells

2.4 NR2F2對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響

我們運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot的方法分別檢測(cè)了OX-NR2F2-4T1組和NC-4T1組細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin mRNA及其蛋白的表達(dá)(圖4)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NR2F2后，E-cadherin mRNA的表達(dá)量降低，而Vimentin、N-cadherin mRNA表達(dá)量增加。Western blot的檢測(cè)結(jié)果相似，與NC-4T1組相比，OX-NR2F2-4T1組的E-cadherin的蛋白表達(dá)水平降低，而Vimentin、N-cadherin的蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)。這提示NR2F2可以促進(jìn)乳腺癌EMT，而且可能通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、E-cadherin的表達(dá)來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。

A：采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)OX-NR2F2-4T1組和NC-4T1組細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA的表達(dá)，OX-NR2F2-4T1組上皮標(biāo)志物E-cadherin mRNA的表達(dá)量降低，而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin mRNA表達(dá)量增加；B：Western blot檢測(cè)OX-NR2F2-4T1組和NC-4T1組細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)，NR2F2過(guò)表達(dá)后，E-cadherin蛋白水平降低，而Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平升高；C、D、E：EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)結(jié)果分析(n=3)；與NC-4T1組比較，*P<0.05圖4 NR2F2對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT生物標(biāo)志物表達(dá)的影響Fig.4 Effect of NR2F2 on breast cancer cell EMT biomarkers

3 討論

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中以三陰性乳腺癌的惡性程度高，容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，預(yù)后也最差[17]。EMT被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的起始和關(guān)鍵。EMT是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，期間細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上更加細(xì)長(zhǎng)，遷移侵襲能力增強(qiáng)。在此過(guò)程中上皮細(xì)胞經(jīng)歷了細(xì)胞骨架的重塑，可能會(huì)失去促進(jìn)細(xì)胞間接觸的蛋白(如E-cadherin和γ-catenin)，細(xì)胞間充質(zhì)分子標(biāo)志物(如波形蛋白、纖維連接蛋白、N-cadherin、金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9等)表達(dá)上調(diào)[18]。越來(lái)越多的研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而且在惡性腫瘤的遷移侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著重要角色。

轉(zhuǎn)錄因子NR2F2被證實(shí)在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19-23]。研究表明，多種惡性腫瘤組織高表達(dá)NR2F2，且NR2F2的表達(dá)水平與腫瘤惡性程度相關(guān)[24]。進(jìn)一步研究認(rèn)為，NR2F2可能通過(guò)影響細(xì)胞增殖、血管和淋巴管的生成等影響腫瘤進(jìn)展。Zheng等[25]發(fā)現(xiàn)敲除NR2F2后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡增加。Chen等[26]發(fā)現(xiàn)NR2F2可以直接與E2F1啟動(dòng)子上的Sp1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，直接調(diào)控E2F1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期。Qin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，NR2F2可以調(diào)控血管生成素信號(hào)通路從而調(diào)控腫瘤血管的生成。

目前對(duì)于NR2F2在腫瘤轉(zhuǎn)移中的機(jī)制研究停留在細(xì)胞分子水平，需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持。NR2F2作為一個(gè)較為保守的基因，在人和小鼠中具有高度的同源性，利用BALB/c小鼠接種小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞復(fù)制乳腺癌模型是實(shí)驗(yàn)室常用的研究方法。已有研究表明，綠色熒光蛋白GFP對(duì)4T1細(xì)胞的遷移侵襲以及EMT的相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)沒(méi)有影響[27]。因此，在本研究中，我們采用帶有綠色熒光GFP和嘌呤霉素抗性的慢病毒為載體，通過(guò)感染細(xì)胞，嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NR2F2的工具細(xì)胞，并開(kāi)展相關(guān)研究。經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡下確認(rèn)，篩選出的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，提示慢病毒感染成功。實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot的檢測(cè)結(jié)果顯示，NR2F2 mRNA和蛋白的表達(dá)都明顯高于對(duì)照組，均提示穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NR2F2的4T1細(xì)胞構(gòu)建成功。

NR2F2促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT。顯微鏡下觀察到，與對(duì)照組相比，NR2F2過(guò)表達(dá)細(xì)胞形態(tài)更加細(xì)長(zhǎng)，即發(fā)生間質(zhì)表型改變。接下來(lái)我們通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NR2F2細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，過(guò)表達(dá)NR2F2后，細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。以上提示，過(guò)表達(dá)NR2F2可能促使乳腺癌細(xì)胞發(fā)生了由上皮表型向間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)換，細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強(qiáng)。

NR2F2通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)標(biāo)志物引起EMT。我們對(duì)比檢測(cè)了過(guò)表達(dá)NR2F2和對(duì)照細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NR2F2的乳腺癌細(xì)胞中上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，而間質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增多，這些也提示細(xì)胞發(fā)生EMT。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，NR2F2參與了EMT的調(diào)控，NR2F2可能通過(guò)調(diào)控EMT上游基因的表達(dá)影響EMT相關(guān)marker的表達(dá)[28]。Bao等[23]通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，NR2F2可直接靶向Snail1的啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)Snail1及其下游EMT相關(guān)基因的表達(dá)。Bao等[29]還發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中NR2F2可以下調(diào)miR34a表達(dá)，從而使Vimentin上調(diào)，E-cadherin下調(diào)，促進(jìn)了EMT的發(fā)生。Xia等[30]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中敲除NR2F2可以減弱胰島素誘導(dǎo)的EMT，使N-cadherin、Vimentin下調(diào)，E-cadherin上調(diào)。Hao等[31]發(fā)現(xiàn)NR2F2在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，并且可以直接轉(zhuǎn)錄激活miR-21，下調(diào)Smad7，從而促進(jìn)了TGF-β誘導(dǎo)的EMT。

綜上所述，我們通過(guò)慢病毒感染4T1細(xì)胞，成功構(gòu)建了帶有綠色熒光的穩(wěn)定表達(dá)NR2F2小鼠三陰性乳腺癌細(xì)胞株，并發(fā)現(xiàn)，NR2F2通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng)，進(jìn)而可能導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和與EMT相關(guān)化療藥物耐藥等。以轉(zhuǎn)錄因子NR2F2為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)可能為三陰性乳腺癌患者的臨床治療提供新的思路。