窖泥中降乳增己菌群的馴化及其在白酒發(fā)酵中的應用

王琪，李一關，許長山，祝剛強，陳建新*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(合肥包河酒業(yè)有限公司，安徽 合肥，230041) 3(河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司，河北 衡水，053000)

白酒是我國的傳統(tǒng)食品，具有悠久的歷史和文化，是世界六大蒸餾名酒之一[1]。白酒根據(jù)風味的不同主要可分為3大類：濃香型白酒、清香型白酒和醬香型白酒，其中濃香型白酒占白酒總產(chǎn)量的70%[2]。濃香型白酒含有120余種酯類，其中己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯最為重要[3]。己酸乙酯和乳酸乙酯為濃香型白酒的主要呈香物質(zhì)。業(yè)界普遍認為，濃香型白酒中己酸乙酯和乳酸乙酯保持適當?shù)谋壤?如1∶0.5～0.9)，能使?jié)庀阈桶拙浦黧w香突出，香、味協(xié)調(diào)，酒體典型性強[4]；乳酸乙酯過高，主體香受抑制，香味失調(diào)；乳酸乙酯過低，酒味欠濃厚，酒體欠完整[5]。

由于自然界中可產(chǎn)生乳酸的微生物非常多，乳酸與乙醇在酯化酶的作用下生成乳酸乙酯，導致乳酸乙酯在固態(tài)白酒中含量較多，有時甚至超過己酸乙酯，香味失調(diào)，嚴重影響了白酒的風味與質(zhì)量[4]。因此古往今來，“降乳增己”一直是我國很多濃香型白酒企業(yè)面臨的主要技術問題[6]。發(fā)酵過程中，芽孢梭菌等微生物通過β-氧化逆循環(huán)進行的羧酸鏈延長過程合成己酸[7-8]。在該過程中，一般由乙醇或乳酸作為電子供體，相對于乳酸，使用乙醇作為電子供體合成己酸在熱力學方面具有能量增益的優(yōu)勢[8]。而ZHU等[9]從濃香型白酒發(fā)酵中獲得了代謝乳酸生產(chǎn)己酸鹽的獨特微生物組，證實了馴化降乳增己菌的可行性。

傳統(tǒng)濃香型白酒釀造多在窖池中進行[10]，窖泥中存在著己酸菌等產(chǎn)生濃香型白酒風味物質(zhì)的功能微生物[11]，同時窖泥也向酒醅中傳輸其發(fā)酵過程中積累的揮發(fā)性風味物質(zhì)，特別是吡嗪類等的微量香味成分使老窖所產(chǎn)白酒比較柔和協(xié)調(diào)[12]。但是，由于窖池中白酒發(fā)酵屬于天然發(fā)酵[13]，難以精準控制發(fā)酵過程，同時發(fā)酵周期較長。當前已有學者對無泥窖濃香型白酒展開研究[14]，但鮮少有搭建降乳增己體系的報道。本研究旨在以濃香型白酒窖泥樣品中的微生物作為出發(fā)菌群，高乳酸鹽濃度模擬黃水為載體，在生物反應器中進行以乳酸轉(zhuǎn)化為己酸為目的的反應體系的構建，摸索生物反應器降乳增己最佳條件，馴化濃香型白酒窖泥中降乳增己菌群，促進發(fā)酵液中乳酸至己酸的轉(zhuǎn)化，添加適宜載體培養(yǎng)降乳增己菌群生物膜，得到穩(wěn)定菌群，并將其運用于模擬發(fā)酵，探討添加時機和添加量對白酒發(fā)酵降乳增己的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

白酒發(fā)酵原料(高粱、小麥、麩皮、稻殼、酒曲、酒糟等)、窖泥、出窖酒醅，某酒廠；1 cm改性聚氨酯海綿，江蘇艾勤環(huán)?？萍加邢薰荆?；顆粒狀活性炭，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器與設備

GC2010氣相色譜儀、GC2010 Plus氣相色譜儀，日本島津公司；VS-1300潔凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，邦西儀器科技(上海)有限公司；1260 Infinity液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Pico17高速離心機，美國賽默飛世爾科技公司；定制玻璃反應容器，聯(lián)華玻璃儀器廠；HL-2B數(shù)顯恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；TF-HX-10智能恒溫循環(huán)器，上海田楓實業(yè)有限公司；FiveEasy實驗室pH計，瑞士梅特勒托利多集團。

1.2.2 培養(yǎng)基與試劑

強化梭菌培養(yǎng)基(reinforced clostrdium medium，RCM)(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸出膏10，酵母膏3，無水葡萄糖5，可溶性淀粉1，NaCl 5，無水乙酸鈉3，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

模擬黃水培養(yǎng)基：在RCM中添加不同量的乳酸鹽模擬發(fā)酵黃水。

甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳酸鈉、乳酸、H3PO4、無水乙醇、ZnSO4、甲醇、NaOH、亞鐵氰化鉀、NaH2PO4，國藥集團化學試劑有限公司；乙醇(色譜純)，2-乙基丁酸，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 反應體系的搭建

在實驗室中搭建反應體系，如圖1和圖2所示。

圖1 窖泥反應裝置示意圖Fig.1 The biological reactor of pit muds

a-裝置A;b-裝置B;c-裝置C圖2 窖泥反應裝置實體圖Fig.2 The biological reactor of pit muds

在定制玻璃反應容器A的2個反應器中內(nèi)(容積為1 L)加入改性聚氨酯海綿1 cm正方體至瓶頸處，加入10 g窖泥，將裝置A-1和A-2串聯(lián)，采用夾套控溫法，使用TF-HX-10智能恒溫循環(huán)器控制窖泥反應的培養(yǎng)溫度為37 ℃。0～24 d將RCM用HL-2B數(shù)顯恒流泵以0.5 r/min的轉(zhuǎn)速泵入上述反應器內(nèi)(流速約為6 mL/h)，24 d后在培養(yǎng)基中加入20%(體積分數(shù))乳酸鈉溶液并用乳酸將pH值調(diào)至5.0～5.5模擬黃水進行循環(huán)反應，嚴格控制厭氧培養(yǎng)。

在定制玻璃反應容器B的2個柱狀反應器中內(nèi)(容積為180 mL)先加入5 g活性炭，再加入改性聚氨酯海綿1 cm正方體至瓶頸處，加入5 g窖泥，具體培養(yǎng)方法同裝置A。

在玻璃裝置C(容積為500 mL)中加入適量改性聚氨酯海綿1 cm正方體后再加入5 g窖泥，水浴37 ℃培養(yǎng)，初始培養(yǎng)基為窖池發(fā)酵黃水，非連續(xù)進樣，0～24 d每天固定時間將RCM以6 mL/h進料30 mL，24 d后在培養(yǎng)基中加入20%(體積分數(shù))乳酸鈉溶液并用乳酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，每天以相同速率進料30 mL。

收集反應液，測定各揮發(fā)性組分含量與乳酸的產(chǎn)量或消耗量的速率，進行比較和分析。

1.3.2 揮發(fā)性物質(zhì)濃度的測定

揮發(fā)性物質(zhì)采用氣相色譜儀測定[15]。

1.3.3 乳酸濃度的測定

乳酸濃度采用液相色譜測定[16]。乳酸標準曲線為y=408.69x-10.648，R2=0.998 2。

1.3.4 基因組提取、高通量測序及數(shù)據(jù)處理

基因組提?。何∫欢康木喊l(fā)酵液(強化黃水)，離心棄上清液，超純水洗滌沉淀1次。洗滌后的細胞基因組提取及純化按照細菌快速抽提試劑盒說明書進行提取。

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增：采用原核微生物通用引物338F_806R對上述基因組進行PCR擴增，PCR采用TransGen AP221-02，TransStart Fastpfu DNA Polymerase。

高通量測序分析和數(shù)據(jù)處理：對上述PCR擴增產(chǎn)物進行純化、連接高通量測序接頭、構建DNA文庫及高通量測序(Illumina Miseq)。使用Cutadapt(Martin M., V1.9.1)軟件對數(shù)據(jù)進行過濾和質(zhì)控后通過UCHIME Algorithm[17]與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測并去除嵌合體序列[18]，得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)[19]對有效數(shù)據(jù)進行聚類。用Mothur方法與SILVA[20]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[21]進行物種注釋分析。按最小樣本序列數(shù)抽平后進行后續(xù)分析。使用Qiime軟件(Version 1.9.10)和R軟件(Version 2.15.3)進行多樣性分析。

1.3.5 實驗室模擬入窖發(fā)酵

濃香型白酒工藝流程主要為高粱粉碎、高溫蒸糧、泥窖發(fā)酵、續(xù)糟配料、混蒸混燒。實驗室模擬發(fā)酵采用單糧發(fā)酵，其中糧醅質(zhì)量比1∶4.5，糧曲質(zhì)量比3∶1，糧水質(zhì)量比1∶0.9，糧食與稻殼質(zhì)量比 4.6∶1。窖池發(fā)酵裝置是定制的容積為9.5 L的不銹鋼桶，高度為35 cm，在潤好的高粱中加入酒廠出窖酒醅，與清蒸稻殼按比例混合均勻后取5 kg裝入定制不銹鋼桶內(nèi)，按表1發(fā)酵條件操作，密封封口后放入培養(yǎng)箱進行發(fā)酵，入窖周期為30 d。

表1 模擬發(fā)酵條件Table 1 Conditions of fermentation

發(fā)酵結(jié)束后使用實驗室自主設計甑桶蒸餾酒醅酒樣，成品酒中風味物質(zhì)用氣相色譜測定。酒醅樣品理化指標如還原糖、酸度、淀粉、含水率和酒精度測定采用白酒酒醅分析方法[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 新型窖泥反應體系的構建

2.1.1 選定實驗裝置

對各裝置中的乙酸、丁酸和己酸含量用氣相色譜測定，結(jié)果如圖3所示。

a-裝置A-1發(fā)酵液；b-裝置A-2發(fā)酵液；c-裝置B-1發(fā)酵液；d-裝置B-2發(fā)酵液；e-裝置C-1發(fā)酵液；f-裝置C-2發(fā)酵液；圖3 各裝置發(fā)酵液中3種酸質(zhì)量濃度Fig.3 Concentration of three acids in fermentation broth of each reactor

由圖3-a和3-b可知，裝置A-2與裝置A-1相比，發(fā)酵液中己酸含量穩(wěn)步提升，表明裝置中產(chǎn)己酸菌活性增強。由圖4-c可知，裝置B-1在培養(yǎng)35 d時出現(xiàn)漏液，重新泵入RCM后己酸含量與裝置B-2相比明顯較低，間接反映通過泵入高乳酸鹽濃度的模擬黃水能夠促進反應體系中的菌群降解乳酸生產(chǎn)己酸，馴化降乳增己菌群具有可行性。由圖3-d可知，裝置B-2在培養(yǎng)45 d后己酸含量顯著增加，最高達12.85 g/L，較初始濃度提高9.55倍。由圖3-e和圖3-f可知，裝置C-1和C-2在培養(yǎng)過程中己酸含量降低，增己效果不理想，可能是水浴控溫不穩(wěn)定且不同位置溫度存在略微差異影響反應體系內(nèi)的菌體活性，同時非連續(xù)進樣可能抑制菌體活力。

表2 四個裝置進出料乳酸質(zhì)量濃度 單位：g/L

由表2和圖4可知，裝置A-1在加入模擬黃水后開始具有極高的乳酸轉(zhuǎn)化能力，乳酸轉(zhuǎn)化率高達81.72%，降乳效果明顯，但隨著培養(yǎng)時間的增加，在41 d后乳酸轉(zhuǎn)化率明顯下降，推測是由于降乳酸菌降乳酸能力達到閾值。裝置B-1和B-2隨著培養(yǎng)時間的增長，日轉(zhuǎn)化速率波動提高，其中裝置B-2最大日轉(zhuǎn)化速率達到10.05 g/L。裝置A-1與裝置A-2串聯(lián)，在41 d時裝置A-1中降乳酸菌降乳酸能力達到飽和，使得裝置A-2進料乳酸濃度顯著增加，由圖4可知，此后裝置A-2中乳酸轉(zhuǎn)化率呈正增長，表明通過在反應器中提高乳酸鹽含量促進降乳酸菌降乳能力具有可行性。綜合3種裝置增己和降乳效果，柱狀反應器在連續(xù)進料條件下載體與菌群接觸面積更大，有利于固定目的菌群生成生物膜，增強了菌體活力，發(fā)酵液在乳酸含量下降的同時己酸含量增加，降乳增己綜合效果最好，確定用夾套柱狀反應器構建窖泥降乳增己菌馴化體系。

a-乳酸轉(zhuǎn)化率；b-乳酸轉(zhuǎn)化速率圖4 四個裝置乳酸轉(zhuǎn)化情況Fig.4 Change of lactic acid in four reactors

2.1.2 乳酸鹽添加量的確定

在3個選定的定制玻璃柱狀反應器(裝置1、裝置2、裝置3)中先加入5 g活性炭，再加入改性聚氨酯海綿1 cm正方體至瓶頸處，加入5 g窖泥，采用夾套控溫法，使用TF-HX-10智能恒溫循環(huán)器控制窖泥的培養(yǎng)溫度為37 ℃。0～3 d時將RCM用HL-2B數(shù)顯恒流泵以0.5 r/min的轉(zhuǎn)速泵入上述反應容器內(nèi)(流速約為6 mL/h)，3 d后在培養(yǎng)基中分別加入40、20、10 g/L乳酸鈉溶液并用乳酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，模擬黃水進行培養(yǎng)，嚴格控制厭氧培養(yǎng)。

由圖5可知，在培養(yǎng)過程中，裝置1始終保持較高的乳酸轉(zhuǎn)化率，最高達41.25%，日轉(zhuǎn)化率達13.25 g/L。同時由前實驗可知己酸含量穩(wěn)步上升，最高達10.71 g/L，較初始濃度提高289.2%，這與ZHU等[9]添加乳酸鹽后裝置內(nèi)己酸含量增加的結(jié)果相符。裝置2和裝置3的乳酸轉(zhuǎn)化率最高分別為29.78%和27.12%，己酸最大質(zhì)量濃度為9.22和7.38 g/L。綜合降乳增己情況，在裝置1的操作條件下效果最好，確定模擬黃水中乳酸鹽添加量為40 g/L。

a-乳酸轉(zhuǎn)化率；b-乳酸轉(zhuǎn)化速率圖5 三個裝置乳酸轉(zhuǎn)化情況Fig.5 Change of lactic acid in three reactors

2.2 操作分類單元聚類和物種相對豐度分析

測序結(jié)果經(jīng)過嚴格的數(shù)據(jù)質(zhì)控，將相似性高于97%的序列聚類成操作分類單元(operational taxonmic units，OTU)。裝置1、2、3中的發(fā)酵液分別對應樣本a1、b1、c1。樣本d1為窖泥樣本。由圖6可知，a1、b1、c1、d1四個樣品細菌共檢出1 567個OTU，其中共有相同種類78個。4個樣品特有的微生物種類分別是10、9、4、693，表明窖泥出發(fā)菌群在馴化過程中，其群落組成可能發(fā)生了變化，發(fā)酵液中降乳增己菌群較窖泥出發(fā)菌群的微生物群落多樣性降低，這與曾田等[23]的研究結(jié)果相符，猜測在馴化過程中優(yōu)勢菌群向降乳增己菌群傾斜。

圖6 基于OTU的Venn圖Fig.6 The venn diagram of operational taxonomic unit

圖7 屬水平上的細菌物種相對豐度柱形圖Fig.7 The bar graph of bacterial relative abundance of species at genus level

根據(jù)分類學分析結(jié)果，可以得知不同樣本在域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU等分類水平上的群落結(jié)構組成情況。由圖7可知，降乳增己效果最好的裝置1發(fā)酵液中梭菌屬(Clostridium)占主要優(yōu)勢，與目前已報道的產(chǎn)己酸微生物主要集中在Clostridium屬，如C.kluyveri,C.sp.BS-1和C.celerecrescens等[24-25]的結(jié)論相符。胡曉龍等[26]對河南某濃香型白酒企業(yè)35年窖齡窖泥微生物用高通量測序技術進行解析，得到優(yōu)勢菌屬為厚壁菌門與擬桿菌門，與本研究結(jié)果相似。同時，Aminobacterium屬也顯著增多，其參與降解氨基酸[27-28]，很可能與提供窖泥菌群豐富的銨態(tài)氮有關。栗連會[29]報道了濃香型白酒釀造環(huán)境中的Bacillus和Clostridium等物種具有降乳酸能力，如C.cochlearium乳酸利用率高達94.1%。在馴化過程中，優(yōu)勢菌群向Clostridium和Aminobacterium傾斜驗證了反應體系降乳增己菌群馴化的可行性。裝置2和裝置3發(fā)酵液中梭菌屬(Clostridium)與窖泥出發(fā)微生物相比也有顯著增加，與己酸含量增加的結(jié)果相符，表明通過生物反應器構建降乳增己體系具有可行性。

2.3 發(fā)酵應用

2.3.1 發(fā)酵罐理化指標變化分析

在發(fā)酵過程中酸度、水分、淀粉、酒精含量等酒醅理化指標與最終原酒的品質(zhì)息息相關。發(fā)酵30 d后酒醅中的各項理化指標如表3所示。

表3 發(fā)酵罐中酒醅理化指標Table 3 Physical and chemical indicators of fermenting grains

由表3可知，4個發(fā)酵罐中的酒醅理化指標偏差不大，某些指標有細微差別，表明添加強化黃水對白酒發(fā)酵的過程干擾較小，具有放大實驗應用于工廠的實際意義。添加了強化黃水的發(fā)酵罐中酒醅的酸度高于未添加的對照組，可能和強化黃水中的優(yōu)勢菌Clostridium屬產(chǎn)己酸[24-25]以及Proteiniphilum屬產(chǎn)乙酸和丙酸等有關[30]。在發(fā)酵初始添加強化黃水的發(fā)酵罐酒醅中水分最高，水是微生物代謝的產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中逐漸累積，推測在發(fā)酵初始含有豐富微生物的強化黃水的添加使得酒醅發(fā)酵中的微生物量或多樣性增加，代謝較對照組旺盛，故水分及酸度較高，同時糖化力的增強使得淀粉消耗量以及還原糖含量偏高，這與夏培禹等[31]將復合窖泥功能菌液應用于濃香型白酒生產(chǎn)測得的酒醅理化指標結(jié)果相符。表明添加強化黃水在不影響白酒正常發(fā)酵的情況下對白酒風味與品質(zhì)的提高有積極作用。

2.3.2 發(fā)酵原酒成分分析

發(fā)酵結(jié)束后使用實驗室自主設計甑桶蒸餾酒醅酒樣，成品酒中風味物質(zhì)用氣相色譜測定。成分分析如表4所示。

由表4可知，添加了強化黃水的發(fā)酵罐2和4發(fā)酵原酒中己酸乙酯明顯高于未添加強化黃水的對照組1和3。對照組中的乳酸乙酯含量均高于己酸乙酯，使白酒主體香受抑制、香味不突出。在0 d添加70 mL強化黃水發(fā)酵罐的發(fā)酵原酒中己酸乙酯含量高達561.9 mg/L，較未添加強化黃水對照組提高330.9%，但同時乳酸乙酯含量也有所提升。而發(fā)酵7 d后添加強化黃水的原酒與對照組相比己酸乙酯增加154.6%的同時乳酸乙酯下降9.8%，m(己酸乙酯)∶m(乳酸乙酯)≈1∶0.62，比例合宜。說明白酒發(fā)酵中添加強化黃水有利于增加己酸乙酯含量、降低乳酸乙酯及乙酸乙酯的含量。己酸及丁酸均為合成己酸乙酯的前體物質(zhì)，實驗組中己酸及丁酸的產(chǎn)生量要高于對照組，推測強化黃水的添加可使發(fā)酵過程中的產(chǎn)己酸等合成己酸乙酯前體物質(zhì)微生物增殖，進而促使實驗組中己酸乙酯的含量相對增高。表4中甲醇含量異常，可能是由于實驗室稻殼存放過久累積大量甲醇，清蒸稻殼時間把握不到位，沒能將稻殼中甲醇等不良物質(zhì)去除徹底所致。強化黃水中豐富的微生物在白酒發(fā)酵過程中起到了積極的作用，尤其是降乳增己菌群，驗證了添加強化黃水在白酒發(fā)酵過程中降乳增己的可行性，為濃香型白酒生產(chǎn)過程中降乳增己的實現(xiàn)提供理論支持。

表4 發(fā)酵原酒成分分析Table 4 Comparison of compounds in different samples

3 討論與結(jié)論

本研究以某酒廠正常窖泥為原料，用定制柱狀反應器搭建新型窖泥反應體系，采用夾套控溫法，控制窖泥反應的培養(yǎng)溫度為37 ℃。將RCM以0.5 r/min的轉(zhuǎn)速泵入上述反應容器內(nèi)(流速約為6 mL/h)活化窖泥菌群后，在培養(yǎng)基中加入40 g/L乳酸鈉溶液并用乳酸將pH值調(diào)至5.0～5.5模擬黃水進行培養(yǎng)，馴化降乳增己菌群效果顯著，己酸最高質(zhì)量濃度達10.71 g/L，較初始濃度提高289.2%，乳酸利用率最高達41.25%。柱狀反應器中載體與菌體接觸面積大，有利于菌體附著生成生物膜從而提高菌體產(chǎn)能，高濃度乳酸鹽的添加促進了降解乳酸合成己酸的微生物的增殖，降低乳酸含量的同時增加己酸含量。

對上述發(fā)酵液和窖泥樣本進行高通量測序分析，馴化后的菌群較窖泥出發(fā)菌群的微生物群落多樣性降低，優(yōu)勢菌群向降乳增己相關菌群傾斜，其中梭菌屬(Clostridium)占主要優(yōu)勢，而大量研究表明梭菌屬(Clostridium)與生產(chǎn)己酸和降解乳酸息息相關。

將上述發(fā)酵液運用于白酒模擬發(fā)酵，不同階段添加70 mL強化黃水發(fā)酵得到的原酒中己酸乙酯含量均比未添加強化黃水的對照組高。在0 d添加70 mL強化黃水發(fā)酵罐的發(fā)酵原酒中己酸乙酯含量高達561.9 mg/L，較未添加強化黃水對照組提高330.9%。而發(fā)酵7 d后添加強化黃水的發(fā)酵原酒與對照組相比己酸乙酯增加154.6%的同時乳酸乙酯下降9.8%，m(己酸乙酯)∶m(乳酸乙酯)≈1∶0.62，比例合宜，驗證了添加強化黃水在白酒發(fā)酵過程中降乳增己的可行性。不同階段添加強化黃水得到的原酒在乳己比上存在一定差異，添加時機和添加量對白酒發(fā)酵降乳增己的影響還有進一步探討的空間。

“降乳增己”是提高濃香型白酒質(zhì)量的關鍵技術，主要研究如何科學合理地在降低乳酸乙酯含量同時增加己酸乙酯含量，使酒體香味協(xié)調(diào)。本研究尚有很多進步空間，例如摸索培養(yǎng)條件進一步提高發(fā)酵液中己酸含量，對馴化得到的降乳增己菌群進行深入研究，明晰其降乳增己的反應機理。同時，在白酒發(fā)酵中添加強化黃水對提高白酒風味與品質(zhì)具有積極作用，不同操作條件得到的白酒品質(zhì)不同，添加時機和添加量對白酒發(fā)酵降乳增己的影響還需要進一步的探討。