石斛提取物與糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)研究進展

俞越，李春霞，史春

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致全球工作年齡人群視力障礙和失明的主要原因之一，大約1/3的糖尿病患者發(fā)生視力損害。目前，用于治療DR 的主要有效方法包括視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)、玻璃體切割術(shù)、皮質(zhì)類固醇或抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治療，這些方法雖有效果，但不能完全消除疾病的進展或逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜損傷[1-4]。中藥是用于預(yù)防、治療、診斷疾病并具有康復(fù)與保健作用的物質(zhì)。其中石斛是我國的名貴藥材，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》[5]：“主傷中，除痹，下氣，補五臟虛勞，羸瘦，強陰，久服厚腸胃，輕身延年”。在2015 年版《中華人民共和國藥典》[6]中收錄了4 種石斛，分別為鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛和流蘇石斛，其具有多種化學(xué)成分。近年來，國內(nèi)外研究[6-9]發(fā)現(xiàn)，降血糖、抗血管生成、抗炎、抗氧化應(yīng)激等是石斛主要的藥理活性。本文就石斛總提取物及石斛酚、石斛多糖、毛蘭素、石斛堿對DR 的作用及機制進行論述。

1 石斛的化學(xué)成分及主要特征

石斛的主要化學(xué)成分為聯(lián)芐類、多糖類、菲類、生物堿類和香豆素類等[9]。多糖類是石斛的主要成分之一，抗氧化及降血糖是石斛多糖的主要作用。廖瀅等[10]發(fā)現(xiàn)，酸性多糖抗氧化活性與糖醛酸官能團含量正相關(guān)，與硫酸糖含量負相關(guān)。

石斛堿是金釵石斛的特征性成分，具有顯著的生物活性，常作為金釵石斛定性定量的重要指標?！吨腥A人民共和國藥典》[6]規(guī)定金釵石斛的石斛堿含量不得低于0.4%。汪代芳等[11]從金釵石斛中分離出11 種化合物，其中包括2 個石斛素型生物堿：石斛堿、石斛醚堿；5 個有機胺類生物堿：N-反式桂皮酸酰對羥基苯乙胺，N-反式阿魏酸酰對羥基苯乙胺，N-順式阿魏酸酰對羥基苯乙胺，N-反式香豆酰酪胺，N-順式香豆酰酪胺。

聯(lián)芐類與菲類具有良好的體外抗血管生成及清除自由基的作用。目前已從7 種石斛中提取到9 種具有菲核的化合物，從5 種石斛中提取到8 種具有9、10-雙氫菲母核的化合物，從4 種石斛中提取到5 種具有菲醌母核的化合物；從14 種石斛中提取出15 種具有聯(lián)芐類母核的化合物。其中石斛酚、毛蘭素、杓唇石斛素、鼓槌聯(lián)芐及鼓槌石斛素均屬于石斛中的聯(lián)芐類化合物，石斛酚的含量為0.0004%～0.391%；杓唇石斛素的含量為0.001%～0.244%；毛蘭素的含量為0.001%～1.68%；鼓槌聯(lián)芐的含量為0.001%～0.044%；鼓槌石斛素的含量為0.001%～0.027%[12]。

香豆素類具有良好的擴張血管、抗凝血等功能，其主要包括香豆素（coumarin）、東莨菪內(nèi)酯（scopoletin）、濱蒿內(nèi)酯（scoparone）和澤蘭內(nèi)酯（ayapin）。通過鑒定發(fā)現(xiàn)香豆素的含量為0.0050%～0.0623%；東莨菪內(nèi)酯的含量為0.0038%～0.0164%；濱蒿內(nèi)酯為0.0087%～0.34%；澤蘭內(nèi)酯為0.005%～0.197%[12]。

2 石斛提取物與DR 的相關(guān)研究

2.1 石斛總提取物與DR

石斛自古以來就是治療消渴的專藥。目前研究發(fā)現(xiàn)，石斛總提取物在DR 的動物模型中有治療作用。石斛總提取物可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）上VEGF 誘導(dǎo)的毛細血管生成，還可以通過上調(diào)胰島素的分泌、促進肝糖原的合成、降低胰高血糖素分泌的方式起到抗糖尿病的作用[13]。宓文佳等[14]研究了石斛根提取物對糖尿病鼠的降糖作用。運用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）造模的糖尿病大鼠在使用鐵皮石斛根提取物后，血糖、糖化血紅蛋白、血清胰島素等檢測指標均下降，表明鐵皮石斛根提取物可以降低2 型糖尿病模型小鼠的空腹血糖，并能有效改善小鼠的毛色、體溫、活動量，生活質(zhì)量和口服糖耐量。高瑋等[15]研究了鼓槌石斛乙醇提取物對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)因子表達的影響。病理結(jié)果顯示，鼓槌石斛乙醇提取物干預(yù)后的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層界限較糖尿病組清晰，神經(jīng)節(jié)細胞層腫脹減輕；免疫組化結(jié)果顯示，藥物干預(yù)組的大鼠只在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、色素上皮層存在Caspase-3 陽性表達，且呈劑量依賴性遞減。這些結(jié)果提示，鼓槌石斛乙醇提取物可能通過抑制細胞凋亡對糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜組織病變起到保護作用。Lee 等[16]研究了鼓槌石斛乙醇提取物對DR 的效果及其機制。視網(wǎng)膜熒光染色結(jié)果顯示，鼓槌石斛乙醇提取物可降低STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管的異常增殖；q-PCR 結(jié)果表明，它可以降低VEGF、VEGFR-2 mRNA 的表達以及血清中VEGF 的水平；糖尿病組在治療后，視網(wǎng)膜MMP2/9、血清MMP2/9、血小板衍生生長因子A/B、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、p65 磷酸化和ICAM-1 的水平被抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明，鼓槌石斛乙醇提取物對炎性因子和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)緊密連接蛋白有抑制作用。

2.2 石斛酚與DR

石斛酚是從石斛中提取出的一種聯(lián)芐類化合物，常被作為衡量石斛藥材質(zhì)量的質(zhì)控指標[17]。醛糖還原酶（aldose reductase，AR）是DR 發(fā)病機制中多元醇通路的關(guān)鍵限速酶，AR 的增加會促使1 型糖尿病患者對視網(wǎng)膜病變的易感性增加[18]。魏小勇等[19]研究發(fā)現(xiàn)，石斛酚對AR 的活性有抑制作用。張梅等[8]研究了石斛酚對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞（HRMECs，ACBRI181）中AR 通路和氧化應(yīng)激的作用機制。熒光探針DCFH-DA 活性氧檢測結(jié)果顯示，各石斛酚組的HRMECs 中活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達均低于高糖組；qRT-PCR 結(jié)果顯示，石斛酚組的缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）/VEGF 表達低于高糖組；Western blotting 結(jié)果顯示，石斛酚各組核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白表達低于高糖組。這些結(jié)果提示，石斛酚能抑制HRMECs 中AR 通路和氧化應(yīng)激反應(yīng)的表達，并能抑制VEGF 的表達。

在DR 早期血-視網(wǎng)膜屏障通透性增強，因此，保護血管內(nèi)皮細胞對于其治療具有重要意義。徐萬里等[20]研究了石斛酚對高糖損傷的人臍靜脈的永生化內(nèi)皮細胞（EA.hy926）的保護作用及其機制。在細胞抗氧化實驗中發(fā)現(xiàn)，在高糖+2.5 μM 石斛酚組中的細胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）低于高糖組，且脂質(zhì)過氧化物丙二醛含量較高糖組增加；細胞活性檢測顯示，使用2.5 μM 的石斛酚干預(yù)后細胞凋亡率低于高糖組。這些結(jié)果提示，石斛酚能抑制半胱天冬酶-3 活性，降低細胞凋亡率，提高細胞活力。此外，石斛酚還可以降低高糖對內(nèi)皮細胞的損傷程度，有助于維護血管的結(jié)構(gòu)和功能完整。

2.3 石斛多糖與DR

降血糖是石斛多糖的主要生物學(xué)作用之一，石斛中含有較多的多糖類成分，粘稠高，總多糖含量最高在30%～45%之間[21-22]。Müller 細胞是一種特化的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，具有維持視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)的功能，在DR 進展中可能起著重要作用。李雅嘉等[23]研究了鐵皮石斛多糖保護糖尿病引起的視網(wǎng)膜損傷的作用機制。MTT 實驗結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖組的Müller 細胞活力高于高糖組，且呈濃度依賴性增加；細胞凋亡實驗顯示，石斛多糖組中的Müller 細胞凋亡低于高糖組，且呈濃度依賴性減少。上述結(jié)果提示，鐵皮石斛多糖可能通過提高Müller 細胞活性，減少Müller 細胞的凋亡，達到保護Müller細胞的作用。

炎癥是DR 的重要發(fā)病機制之一，在DR 早期發(fā)揮了重要作用。李靜文等[24]采用STZ 誘導(dǎo)的SD 大鼠糖尿病模型，探討石斛多糖在早期DR 中的抗炎作用和機制。研究發(fā)現(xiàn)，石斛多糖組中IL-6，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），VEGF 蛋白表達較糖尿病組下降，認為抗炎作用機制可能與其抑制NF-κB 表達有關(guān)。這些結(jié)果提示，石斛多糖可降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中炎性因子及VEGF 的表達。

張貝貝等[25]研究了石斛多糖對糖尿病引起的血管內(nèi)皮細胞損害的作用機制。首先運用qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛組中Bax mRNA 的表達低于高糖組，且隨著鐵皮石斛活性成分濃度的增加，抑制作用增強；隨后運用MTT 法檢測HUVEC細胞活性發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖組的細胞生長優(yōu)于高糖組，細胞凋亡低于多糖組。通過上述研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖可能從基因水平抑制高糖誘導(dǎo)的HUVEC 中Bax mRNA 表達，增強Bcl-2mRNA 表達，抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而達到防治DR 的目的。

2.4 毛蘭素與DR

毛蘭素是普遍存在于石斛中的一種低分子量的天然產(chǎn)物，其抗氧化和抗血管增生作用是其公認的重要藥理作用。鼓槌石斛中分離得到的5 種化合物，分別鑒定為毛蘭素、β-谷甾醇、鼓槌菲、毛蘭菲和鼓槌聯(lián)芐，其中毛蘭素含量最高[26]。同時我國藥典[7]中已確定了毛蘭素作為鑒別鼓槌石斛的主要成分。DR 分為2 個階段：非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）。其中PDR的標志性特征便在于視網(wǎng)膜或視盤表面上異常增殖的新生血管。VEGF 是一種有效的內(nèi)皮細胞有絲分裂原。其作用通過刺激增殖，遷移和管腔的形成，促進新生血管的生成[27-28]。高瑋[29]研究了鼓槌石斛的活性成分毛蘭素對高糖誘導(dǎo)的恒河猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞（RF/6A）的作用機制。結(jié)果顯示，毛蘭素組中PERK-eIF2α-CHOP 信號通路的表達低于高糖組；在使用毛蘭素干預(yù)后RF/6A 細胞中炎性因子IL-1、IL-6 及TNF-α 水平的表達較高糖組降低，且VEGF 信號通路的基因表達低于高糖組。Yu 等[30]探討了毛蘭素對視網(wǎng)膜新生血管形成的抑制機制及其對DR 改善的作用。在體外實驗研究中發(fā)現(xiàn)，毛蘭素可以抑制高糖誘導(dǎo)的RF/6A 細胞中的血管形成，且效果優(yōu)于貝伐單抗，此外，毛蘭素可以抑制RF/6A 細胞中的高糖誘導(dǎo)的HIF-1α 介導(dǎo)的VEGF 表達；在體內(nèi)實驗中還發(fā)現(xiàn)，毛蘭素可以消除STZ 誘導(dǎo)的高血糖小鼠視網(wǎng)膜中的新生血管。上述實驗結(jié)果表明，毛蘭素通過阻斷視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中ERK1/2 介導(dǎo)的HIF-1α 活化來消除高糖誘導(dǎo)的VEGF 表達，并進一步抑制VEGF 誘導(dǎo)的VEGFR2 及其下游信號的激活，從而抑制視網(wǎng)膜新血管生成。Zhang T 等[31]研究鼓槌石斛提取物毛蘭素對于DR 進展中的保護作用發(fā)現(xiàn)，毛蘭素可以減輕血-視網(wǎng)膜屏障的分解，減少小膠質(zhì)細胞活化，ERK1/2 磷酸化，NF-κB 轉(zhuǎn)錄激活和TNF-α表達升高。上述結(jié)果提示，毛蘭素可能通過ERK1/2-NF-κB信號通路抑制高血糖介導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的活化減少視網(wǎng)膜炎癥來減輕DR。

2.5 石斛堿與DR

生物堿類成分是最早從石斛屬植物中分離得到的化合物，也是最早受到關(guān)注和研究的化學(xué)成分。鈴木秀干等首次從金釵石斛中獲得生物堿，命名為石斛堿[21]。通過現(xiàn)代藥理學(xué)研究[6]發(fā)現(xiàn)，降血糖是金釵石斛的主要藥理作用之一，其小分子的化學(xué)成分以石斛堿等生物堿為主，但尚未有研究證明石斛堿與DR 之間的相關(guān)性。

3 小結(jié)

綜上所述，石斛提取物對DR 的發(fā)病機制具有抑制作用，針對石斛中具體組分的研究主要從石斛酚、石斛多糖、毛蘭素等的抗VEGF、抗炎、抗氧化等通路展開。石斛生物堿作為金釵石斛中最重要的成分之一，對于其治療DR 的作用機制尚不可知。此外，膠質(zhì)、神經(jīng)和微血管功能障礙也是引發(fā)DR的重要機制[32]，石斛提取物對于這些機制的效應(yīng)也值得進一步關(guān)注。