基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討川椒方治療過(guò)敏性結(jié)膜炎的作用機(jī)制

李娜，秦虹，王慧娟，宋劍濤

過(guò)敏性結(jié)膜炎（allergic conjunctivitis，AC）是一種以眼癢、異物感、結(jié)膜囊分泌物增多為主要臨床表現(xiàn)的眼部常見(jiàn)變態(tài)免疫性疾病，嚴(yán)重者還會(huì)損傷視功能[1]。目前流行病學(xué)調(diào)查顯示，AC 在眼表疾病的發(fā)病率可高達(dá)30%，尤其好發(fā)于兒童[2]。而且隨著城市工業(yè)化的發(fā)展以及氣候的不斷變化，環(huán)境也隨之變化，這使得過(guò)敏性疾病的發(fā)病率也在不斷增加[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在臨床上常使用抗組胺類(lèi)、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑、糖皮質(zhì)激素類(lèi)、非甾體類(lèi)消炎藥及人工淚液等滴眼液治療AC[4]，這些藥物雖然可部分緩解眼部過(guò)敏癥狀，但療效維持時(shí)間短，且長(zhǎng)期使用可能會(huì)出現(xiàn)眼壓升高、繼發(fā)干眼、角膜上皮損傷等不良反應(yīng)。中醫(yī)根據(jù)AC 發(fā)病特點(diǎn)及臨床癥狀，將其劃分為“目癢”“癢若蟲(chóng)行證”“時(shí)復(fù)癥”的范疇[5]。臨床發(fā)現(xiàn)，中藥不僅能夠有效縮短AC 的病程，減少?gòu)?fù)發(fā)率，還能避免滴眼液帶來(lái)的各種不良反應(yīng)[6]。

高健生[7]根據(jù)臨床治療AC 的經(jīng)驗(yàn)和基于劉完素的“玄府學(xué)說(shuō)”理論，即《素問(wèn)玄機(jī)原病式》[8]中提到的“莫若以辛苦寒藥治之，或微辛熱佐之則可”，創(chuàng)立了川椒方，臨床療效顯著[9]。前期藥理學(xué)研究[10-12]發(fā)現(xiàn)，川椒方可有效改善AC 模型小鼠眼部的過(guò)敏體征，對(duì)過(guò)敏反應(yīng)中肥大細(xì)胞脫顆粒、神經(jīng)肽P 物質(zhì)（substance P，SP）的表達(dá)有一定的抑制作用，還能降低小鼠血清中白細(xì)胞介素-4（interleukin4，IL-4）和血清腫瘤壞死因子（tumor necrosis factorα，TNFα）的含量，最終可緩解小鼠眼結(jié)膜過(guò)敏的急性體征，但是川椒方治療AC 具體的作用機(jī)制仍不明確。故本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，試圖通過(guò)對(duì)川椒方中的藥物活性成分、疾病靶點(diǎn)與藥物-疾病通路間的多維度進(jìn)行研究，為川椒方治療AC 的作用機(jī)制找到新的思路，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 川椒方活性成分的篩選

本研究在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）及中醫(yī)藥百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM）檢索川椒方中各個(gè)藥物的有效活性成分，以口服利用度（oral bioavailability，OB）>30%，類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）>0.18[13]為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。利用TCMSP、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)與之對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白全稱(chēng)，在Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.Unitprot.org）對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并對(duì)結(jié)果進(jìn)行剔重，利用Cytoscape（Version 3.7.2）軟件構(gòu)建“藥物－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 AC 靶點(diǎn)的篩選

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）和人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，https：//www.omim.org）中，以“allergic conjunctivitis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集與AC 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。同時(shí)，在Unitprot 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并對(duì)結(jié)果進(jìn)行剔重。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將川椒方活性成分靶點(diǎn)和AC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集，構(gòu)建韋恩圖（venn），得到的共有靶點(diǎn)為川椒方治療AC 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。將上述關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//stringdb.org），構(gòu)建蛋白-蛋白（protein protein interaction network，PPI）網(wǎng)絡(luò)，設(shè)定物種為人類(lèi)，刪除不相關(guān)聯(lián)的蛋白節(jié)點(diǎn)并導(dǎo)出相關(guān)節(jié)點(diǎn)的度值和組合分?jǐn)?shù)等信息。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因功能分析和信號(hào)通路分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov）進(jìn)行基因功能富集分析（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析（設(shè)定P＜0.05，Q＜0.05），對(duì)富集分析的前20 個(gè)結(jié)果以條形圖和氣泡圖進(jìn)行展示。

1.5 模塊分析

利用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件對(duì)構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析，設(shè)置其決定識(shí)別模塊大小的參數(shù)K-Core 為2。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)收集到川椒方的活性成分85 個(gè)，共得到預(yù)測(cè)靶點(diǎn)2，241 個(gè)。使用Unitprot 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)靶點(diǎn)的基因名，剔除無(wú)效和重復(fù)的靶點(diǎn)，共得到川椒方活性成分作用靶點(diǎn)508個(gè)靶點(diǎn)（圖1），其中靶點(diǎn)數(shù)目較多的前10 位的活性成分（表1）。

圖1 川椒方“藥物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表1 川椒方有效活性成分的基本信息

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索出AC 相關(guān)靶點(diǎn)1,754 個(gè)，去重后共得到1,752 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析

將所得到的川椒方的藥物靶點(diǎn)與AC 的疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，生成韋恩圖，得到183 個(gè)共有靶點(diǎn)（圖2）?；赟tring 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建川椒方治療AC 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3），共得到183 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2,432 個(gè)邊，平均度值為26.6。度值最高的靶點(diǎn)包括：白細(xì)胞介素6（interleukin6，IL-6）、TNF-α、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factorA，VEGFA）等。連接節(jié)點(diǎn)最多的前20 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（表2）。

2.4 GO 生物學(xué)過(guò)程

對(duì)川椒方治療AC 的183 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析，選取排名前20 位的條目進(jìn)行做圖，共得到1,981 個(gè)生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）。在BP 中主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等（圖4A）；71 個(gè)細(xì)胞成分（cell component，CC），在CC（圖4B）中靠前的是囊腔、分泌顆粒腔等。160 條分子功能（molecular function，MF），MF 分析（圖4C）主要與核受體活性、類(lèi)固醇激素受體活性相關(guān)。KEGG 富集分析共得出160 條通路，前20 條信號(hào)通路的氣泡圖如圖5，其中包括血清腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素17（interleukin17，IL-17）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號(hào)通路、核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)信號(hào)通路等。為了直觀反映關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路之間的聯(lián)系，對(duì)川椒方治療AC 的關(guān)鍵通路做了“藥物－關(guān)鍵靶點(diǎn)－通路”網(wǎng)絡(luò)圖，紅色代表信號(hào)通路，綠色代表關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖6、表3）。

圖2 川椒方活性成分靶點(diǎn)和AC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)映射的韋恩圖

圖3 川椒方和AC 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 網(wǎng)絡(luò)的模塊分析

使用Cytoscape 中的MCODE 插件進(jìn)行模塊化分析，結(jié)果顯示scores＞2 的模塊共分為7 類(lèi)，不同模塊對(duì)應(yīng)的參數(shù)見(jiàn)表4。不同的模塊聚類(lèi)富集到相同通路有IL-17 信號(hào)通路、輔助性T 淋巴細(xì)胞17（T helper type 17，Th17）細(xì)胞分化等（表5）。

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AC 的發(fā)病原因多與肺衛(wèi)不固，風(fēng)熱外襲，上犯白睛，或脾胃濕熱內(nèi)蘊(yùn)，復(fù)感風(fēng)邪，風(fēng)濕熱邪相搏，或肝血不足，虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)有關(guān)，從而出現(xiàn)周期性反復(fù)發(fā)作的目癢難忍、白睛紅赤等癥狀，病因與風(fēng)、濕、熱三邪有關(guān)，其治法則以祛風(fēng)止癢、清熱除濕、養(yǎng)血息風(fēng)為主。而高老認(rèn)為AC 的發(fā)病多因六氣、七情化火，每于天時(shí)暑熱之際，體內(nèi)的陽(yáng)熱與外界的濕火之邪相互交感，故使目中之玄府郁閉，神機(jī)升降出入不通利，遂發(fā)為目癢癥。因此，在治療時(shí)不僅要祛風(fēng)、清熱、利濕，還要開(kāi)玄府之郁結(jié)，使氣機(jī)得運(yùn)，故創(chuàng)立川椒方，全方由川椒、地膚子、蛇床子、荊芥、防風(fēng)、川芎、牛蒡子、知母8 味藥物組成，在苦寒藥物中佐以辛熱的川椒，熱因熱用。方中川椒，其性溫味辛，能溫中除濕、辛散行經(jīng)，在《本草綱目》[14]還有“散寒除濕，解郁結(jié)，消宿食，通三焦……”的記載，故可解玄府之濕郁；方中荊芥、防風(fēng)、川芎均為風(fēng)藥，荊芥、防風(fēng)味辛，能散能行，又可解表祛風(fēng)，川芎為“血中之氣藥”，三藥相合以利玄府開(kāi)闔，合玄府之氣血；地膚子，蛇床子寒熱并用，既可清熱利濕，又可散寒燥濕，濕邪得去以暢玄府；知母，牛蒡子清熱瀉火、疏風(fēng)解毒，是故釜底抽薪以清玄府。全方共奏開(kāi)玄化濕、祛風(fēng)清熱之功。

表2 度值較高的川椒方和AC 的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

圖4 川椒方治療AC 的關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 富集分析

圖5 川椒方治療AC 的關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 富集分析

圖6 川椒方治療AC 的“藥物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

表3 川椒方治療AC 的“藥物－關(guān)鍵靶點(diǎn)－通路”相關(guān)信息

表4 川椒方治療AC 的模塊分析

表5 川椒方治療AC 的通路分析

目前的研究[15]表明，AC 的發(fā)病機(jī)制與血清免疫球蛋白E（serum immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的I 型超敏反應(yīng)有關(guān)。接觸致敏原后，變應(yīng)原與結(jié)膜表面的肥大細(xì)胞受體進(jìn)行結(jié)合，當(dāng)再次接觸致敏原后，導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放出組胺、5-羥色胺、蛋白酶等因子，造成血管舒張，血管壁通透性增加，故出現(xiàn)眼瞼結(jié)膜充血、瘙癢等癥狀。致敏原還會(huì)進(jìn)一步激活細(xì)胞免疫，刺激Th1、Th2 細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-6 等細(xì)胞因子，使活化的B 細(xì)胞向IgE 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而加重炎癥的反應(yīng)。但是Th1、Th2 細(xì)胞也會(huì)分泌白細(xì)胞介素-10（interleukin10，IL-10）、干擾素γ（Interferon-γ，IFN-γ）等細(xì)胞因子，而這些細(xì)胞因子有助于穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜，減弱脫顆粒反應(yīng)，從而減輕過(guò)敏的癥狀[16]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到10 種川椒方中的活性成分，靶點(diǎn)數(shù)目位于前三的有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇，其中槲皮素和β-谷甾醇均來(lái)源于川椒。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[17-18]指出，槲皮素可以對(duì)炎癥和免疫作用起到雙向調(diào)節(jié)的作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)穩(wěn)定肥大細(xì)胞、誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞增加細(xì)胞因子IFN-γ 表達(dá)、抑制Th2 細(xì)胞分泌IL-4、阻斷IL-6 分泌和傳導(dǎo)等來(lái)減輕眼部的炎癥反應(yīng)。山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇也均具有抗炎的作用，山柰酚可通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW 264.7 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮和TNF-α[19]，β-谷甾醇、豆甾醇能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌環(huán)氧合酶2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）以及磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylation-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）的表達(dá)[20-21]，進(jìn)而抑制炎癥因子的釋放。

在構(gòu)建川椒方治療AC 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)中，可以發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α、Akt1，VEGFA、前列腺素G/H 合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、胰島素（insulin，INS）等可能是治療過(guò)程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，而這些靶點(diǎn)與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、凋亡以及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)相關(guān)。其中IL-6 可增加血管的通透性，誘發(fā)眼部的炎癥，在結(jié)膜、角膜、虹膜、視網(wǎng)膜等眼科炎癥中均發(fā)揮重要的作用[22]。TNF-α 與炎癥的聯(lián)系也十分緊密[23]，且在治療AC 的臨床實(shí)踐中已經(jīng)證實(shí)TNF-α 和IL-6 可以作為AC 巨大乳頭的生物標(biāo)志物[24]以幫助判斷病情的嚴(yán)重程度和治療效果。

GO 富集分析得出的結(jié)論是川椒方治療AC 可能通過(guò)對(duì)LPS 的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過(guò)程以及細(xì)胞的各個(gè)部位進(jìn)行作用，從而發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，川椒方對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylationendproducts，AGE）-糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of AGEs，RAGE）信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路等多種信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用。模塊分析后得到相同通路包括IL-17 信號(hào)通路和Th17 細(xì)胞分化。最新研究[25]表明，Th17 細(xì)胞分泌的IL-17 可能也與AC 的發(fā)病有關(guān)，因IL-17 能促進(jìn)IgE 細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的聚集，使免疫反應(yīng)處于持續(xù)狀態(tài)。馬琴[26]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)川椒方含藥血清可抑制大鼠嗜堿性白血病粒細(xì)胞（rat basophil leukemia，RBL）-2H3 細(xì)胞株中NF-κB mRNA 的表達(dá)，故也證實(shí)川椒方可能是通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路起到治療作用的。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)驗(yàn)證，川椒方是通過(guò)“多成分－多靶點(diǎn)－多途徑”協(xié)同作用治療AC，發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫等作用。可能通過(guò)IL-6、TNF-α、AKT1、VEGFA 等靶點(diǎn)作用于AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等信號(hào)通路上，但需要對(duì)相關(guān)作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以為中醫(yī)藥治療AC 提供更好的用藥思路。