納米N-TiO2對口腔科環(huán)境消毒效果及抗菌機理的初探*

化萌萌 唐曉君 王亞宇 盧怡 董作青

醫(yī)療場所環(huán)境中的微生物污染問題，一直以來都對于醫(yī)護人員及患者的人身健康存在重大威脅［1］。目前，醫(yī)院根據(jù)環(huán)境等級分類進行消毒工作，以防止交叉感染造成的嚴重后果。臨床上常見的消毒手段包括消毒劑（含氯消毒劑、2%戊二醛等)［2，3］，紫外線殺菌［4］，動態(tài)空氣凈化器［5］等。雖然這些消毒手段可對微生物起到殺滅作用，但是存在作用時間短、對人體有傷害［6］等問題。因此需要一種能夠安全長效發(fā)揮抗菌作用的抗菌劑。

納米TiO2以其光催化活性高及強氧化分解能力等特點而受到關注［7，8］。研究表明，在口腔種植體表面加入改性納米TiO2涂層后，對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌率可達95.29%，具有良好的抗菌效果［9，10］。然而，納米TiO2也存在一定的局限性。由于其禁帶寬度較大，需要紫外光輔助才能完成反應。為此，本研究團隊前期［11］使用氮摻雜技術，完成了高可見活性納米N-TiO2噴劑的規(guī)模化制備及應用，其在室內(nèi)自然光下就能直接將光能轉(zhuǎn)化為化學能。并研究了其對醫(yī)療環(huán)境中物體表面的常見病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念菌株的抗菌性能檢測，已證實具有良好的滅菌效果［12］?，F(xiàn)將納米N-TiO2噴劑用于口腔科臨床環(huán)境中，并與臨床上常用消毒劑健之素進行對比，以期研究其在實際臨床情況下的抗菌性能，并對其抗菌機理進行初探。

1.研究對象與方法

1.1 研究對象 北京市某三甲醫(yī)院口腔科診室中選取牙片室、消毒室和打磨室三種診室作為實驗場所，室內(nèi)溫度控制在22～26℃，濕度50%～65%。每間診室工作人員1名，工作時間嚴格限制其他人員出入。

1.2 實驗材料及設備 納米N-TiO2噴劑（分散劑有效含量為6%、粘度為2mpa·s，質(zhì)量分數(shù)1wt%，平均粒徑＜65nm，相對密度3.8-3.9g/cm2，pH=7-8；北京科技大學提供)；0.9%無菌生理鹽水；健之素消毒劑（其主要成份為三氯異氰脲酸鈉速溶泡騰制劑，每片含有效物250mg，北京長江脈醫(yī)藥科技有限責任公司）。

熒光燈（D50），色溫5000K，顯色指數(shù)大于90%，波長分布在400～780nm。

1.3 實驗分組在每個場所選取15個大小約10cm×10cm的物表，隨機分為實驗組（使用納米N-TiO2進行噴涂，5個），陽性對照組（使用健之素消毒劑進行噴涂，5個）；陰性對照組（使用0.9%無菌生理鹽水進行噴涂，5個）。

1.4 實驗菌株和培養(yǎng)基 大腸埃希氏菌（CGMCC 1.3373)，培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基

1.5 方法

1.5.1 納米N-TiO2噴劑消毒效果的檢測

(1）采樣按照《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》(GB 15982-2012）對實驗物表進行采樣。采樣方法：用5cm×5cm的標準滅菌規(guī)格板，放在被檢物體表面，用沾有無菌生理鹽水的無菌棉拭子在規(guī)格板內(nèi)均勻涂擦10次轉(zhuǎn)動采樣，將被污染部分剪下，其余投入2mL滅菌生理鹽水試管中立即送檢，并進行菌落計數(shù)（CFU/cm2)。

采樣時機：選取下午5點口腔科診療結(jié)束后，采樣前，關閉門、窗，在無人走動的情況下，靜止10min后進行采樣。實驗組和對照組均連續(xù)取樣5天。

(2）消毒方法模擬室內(nèi)自然光照：打開熒光燈（D50），穩(wěn)定0.5h以上，然后調(diào)節(jié)熒光燈高度或功率來調(diào)節(jié)光照強度，采樣照度計測量，記錄測量用光照強度（1000～1500lx），偏差不超過2%。

首先對實驗物表進行物理清潔，然后通過噴涂工藝（壓力0.7MPa，噴槍口徑0.5mm，噴涂時間15s）進行物表消毒。其中，實驗組用納米N-TiO2噴劑進行噴涂消毒，陽性對照組使用健之素進行噴涂消毒，陰性對照組使用0.9%無菌生理鹽水進行噴涂。各組噴涂消毒時間5min。按照上述采樣方法進行細菌培養(yǎng)與計數(shù)。

為避免研究的偏倚，本研究的所有操作和實驗處理均由經(jīng)過培訓的同一個人完成。

(3）評價標準按照《消毒技術規(guī)范》［13］的要求，口腔科環(huán)境分類為Ⅳ類環(huán)境，要求消毒后環(huán)境細菌總數(shù)≤10.0 CFU/cm2。

(4）統(tǒng)計學分析用SPSS軟件22.0版本進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5.2 納米N-TiO2噴劑抗菌機理的初步觀察

為了研究抗菌噴劑的抗菌機理，在100mL濃度為106cfu/mL的大腸桿菌中加入0.1g納米N-TiO2噴劑，然后進行自然光照。在不同光照時間下取出一定量的菌液，進行乙醇脫水，制備樣品進行掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM)，通過觀察大腸桿菌的形貌來研究其殺滅過程。

2.結(jié)果

2.1 納米N-TiO2噴劑消毒效果的檢測

2.2.1 三種方法對實驗物表消毒前后的細菌菌落數(shù)結(jié)果比較（表1，2）在進行消毒前，口腔科各診室物表存在污染，細菌菌落數(shù)均值分別為牙片室279±11.6(CFU/cm2)，消 毒 室197±10.3(CFU/cm2)，打磨室268±12.1(CFU/cm2)；實驗組（納米N-TiO2組）在消毒后各診室實驗物表的細菌菌落數(shù)均值分別為3±1.3(CFU/cm2)，3±0.9(CFU/cm2)，4±0.7(CFU/cm2)，殺菌率為100%，與消毒前差異有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.01)；陽性對照組（健之素組）在消毒后各診室實驗物表的細菌菌落數(shù)均值分別為36±4.7(CFU/cm2)，24±1.3(CFU/cm2)，39±3.2(CFU/cm2)，殺菌率為88.7%，與消毒前差異有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.01)；陰性對照組（0.9%無菌生理鹽水）各診室的實驗物表細菌菌落數(shù) 均 值分 別為267±11.8(CFU/cm2)，189±11.7(CFU/cm2)，269±10.0(CFU/cm2)，與消毒前物表菌落數(shù)無明顯差異（P＞0.05)。

表1 三種方法噴涂后口腔各診室物表的細菌菌落數(shù)（X±S）

表2 口腔各診室物表噴涂納米N-TiO2前后的細菌菌落數(shù)（±S)

表2 口腔各診室物表噴涂納米N-TiO2前后的細菌菌落數(shù)（±S)

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2.1.2 納米N-TiO2噴劑對實驗物表消毒后其表面細菌菌落數(shù)的日間變化（表2）口腔科各診室實驗物體表面噴涂納米N-TiO2后，其表面細菌菌落數(shù)均數(shù)的日間差異不顯著，P＞0.05。

2.2 納米N-TiO2噴劑抗菌機理的初步觀察

2.2.1 大腸桿菌在使用N-TiO2噴劑殺菌過程中的SEM觀察 圖1為未經(jīng)處理的大腸桿菌原始形貌，可知，未經(jīng)處理的大腸桿菌菌體呈兩端鈍圓的直桿狀，長度在0.5-1.5μm之間。視野中的菌體結(jié)構(gòu)均比較完整，飽滿無損傷。

表2 噴涂納米N-TiO2后實驗物體表面細菌菌落數(shù)值（X±S）的日間比較

在經(jīng)5min光催化殺菌處理后，部分菌體的局部出現(xiàn)變形（圖2)；15～30min后，大部分細菌出現(xiàn)了不同程度的結(jié)構(gòu)變形，主要體現(xiàn)為局部皺縮與凹陷（圖3)；60min后發(fā)現(xiàn)，視野中所有細菌基本都出現(xiàn)了較為明顯的變形，菌體表面出現(xiàn)了開放性的破損與孔洞，細胞外層結(jié)構(gòu)被破壞，部分細菌的結(jié)構(gòu)已完全崩塌（圖4)。

圖1 大腸桿菌原始形貌

圖2 光照5 min后的大腸桿菌形貌

圖3 光照15 min、30 min后大腸桿菌的形貌

圖4 光照60 min后大腸桿菌的形貌

2.2.2 大腸桿菌在使用納米N-TiO2噴劑殺菌過程中的TEM觀察 圖5(a）為未經(jīng)處理的大腸桿菌透射電鏡圖，可觀察到完整、光滑的的細胞壁與細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，周質(zhì)間隔緊密，胞漿均勻分布。經(jīng)5min光催化殺菌后，部分細菌內(nèi)部出現(xiàn)了一些淺灰色區(qū)域，如圖5(b)。15min后可見圖5(c）中淺灰色區(qū)域周圍的細胞外層細胞壁與膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的不連續(xù)區(qū)段。圖6(a)(b）為光催化處理30min與60min的部分大腸桿菌樣品，可觀察到有部分細菌的胞內(nèi)物質(zhì)紊亂或已完全消失。

圖5 (a）大腸桿菌原貌；(b）光照5 min后大腸桿菌形貌；(c）光照15 min后大腸桿菌形貌

圖6 (a）光照30 min后大腸桿菌形貌；(b）光照60 min后大腸桿菌形貌

3.討論

醫(yī)院感染控制一直以來都是關注的熱點問題。據(jù)WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球60億人口中，每年大約3億人因病住院治療。其中，平均8.7%的住院病人發(fā)生了不同嚴重程度的醫(yī)院感染［14］。如何對醫(yī)院環(huán)境及物表進行有效消毒，是杜絕院內(nèi)感染的重中之重。目前醫(yī)院的消毒滅菌手段主要有：物理滅菌法（壓力蒸汽滅菌、紫外線消毒、臭氧消毒等）和化學滅菌法（各種化學消毒劑：醛類、過氧化合物類、醇類消毒劑、含氯及含碘消毒劑等）兩大類［15］。但這些現(xiàn)有消毒手段也存在一些局限性，如消毒效果的長效性難以保持，一旦停止消毒，環(huán)境中的病原菌數(shù)量很快回升［16］?；瘜W消毒劑在消毒過程中對設備、器械等有腐蝕性，易分解、產(chǎn)生二次污染。此外，有些病原菌等微生物在對抗消毒劑過程中形成生物被膜，從而阻擋或排除消毒劑分子，最終導致消毒劑失活［17］。

納米TiO2抗菌劑以其抗菌譜廣，無污染等特點近年來成為學者的研究重點。納米TiO2在光的激發(fā)下，產(chǎn)生電子和空穴，把光能轉(zhuǎn)化為化學能，自身不被消耗，具有長效性的特點［7，8］。國內(nèi)外相關研究表明：光催化納米TiO2對革蘭陰性菌，革蘭陰性菌，絲狀菌和單細胞真菌等都有很好的殺滅效果［18］。但TiO2的禁帶寬度為3.2eV，處于紫外區(qū)，只有在紫外光下才能發(fā)揮抗菌作用。本課題組通過同步晶化與氮摻雜技術，以無機助劑為分散系成功制備出了納米N-TiO2噴劑，突破了只能利用紫外光的局限性。通過對醫(yī)院口腔科常見微生物進行調(diào)查，已證實納米N-TiO2對醫(yī)院常見致病微生物有較好的抑菌效果［12］。并已對醫(yī)院診室空氣消毒進行了初期研究［19-21］。

為進一步應用于醫(yī)院臨床實際環(huán)境中，本研究選取口腔科牙片室、消毒室和打磨室三種診室作為實驗場所，使用納米N-TiO2噴劑對實驗物表進行噴涂消毒，同時選用臨床上常用消毒劑健之素作為對照組?？芍谶M行物表消毒前，口腔科各診室物表存在污染，消毒后，實驗組各診室實驗物表的細菌菌落數(shù)均值分別為3±1.3(CFU/cm2)，3±0.9(CFU/cm2)，4±0.7(CFU/cm2)，殺 菌 率 為100%，與消毒前差異有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.01)；陽性對照組各診室實驗物表的細菌菌落數(shù)均值分別為36±4.7(CFU/cm2)，24±1.3(CFU/cm2)，39±3.2(CFU/cm2)，殺菌率為88.7%；陰性對照組各診室的實驗物表細菌菌落數(shù)均值分別為267±11.8(CFU/cm2)，189±11.7(CFU/cm2)，269±10.0(CFU/cm2)。說明納米N-TiO2噴劑消毒效果優(yōu)于健之素。

通過連續(xù)5天動態(tài)監(jiān)測結(jié)果可知，各診室實驗物體表面噴涂納米N-TiO2后，其表面細菌菌落數(shù)均數(shù)的日間差異不顯著（P＞0.05)。在檢測次數(shù)內(nèi)，口腔科實驗物表的菌落數(shù)均達到標準值（10cfu/cm2)。說明，在口腔科實際環(huán)境中納米N-TiO2噴劑具有良好的應用前景。

為了研究抗菌噴劑的抗菌機理，本研究以醫(yī)院環(huán)境中較常見的病原菌大腸桿菌為例，通過觀察其形貌變化來研究納米N-TiO2噴劑的滅菌過程。

SEM觀察可知，在光催化殺菌過程中菌體發(fā)生了較大的形態(tài)改變。這是由于納米N-TiO2噴劑在光照下產(chǎn)生的羥基自由基、超氧自由基、雙陽水等活性氧物質(zhì)攻擊細菌，使構(gòu)成細菌細胞壁和細胞膜的有機物受到氧化。隨著光催化處理時間的增長，觀察到菌體表面出現(xiàn)了開放性的破損與孔洞，細胞外層結(jié)構(gòu)被破壞。部分細菌的結(jié)構(gòu)已完全崩塌。結(jié)合圖1-4可認為細胞內(nèi)部物質(zhì)出現(xiàn)了聚縮或流失，從而在制樣脫水與干燥過程中使得細菌出現(xiàn)皺縮與凹陷。反應過程中外層細胞壁與膜結(jié)構(gòu)由完整到逐漸分解破損，并最終解體。

TEM觀察可知，在納米N-TiO2抗菌噴劑光催化殺菌過程中，細胞壁與細胞膜結(jié)構(gòu)受到活性氧基團的氧化攻擊，細胞的屏障結(jié)構(gòu)破壞，通透性發(fā)生改變，胞內(nèi)K+等流失，環(huán)境中的活性氧集團與一些其他離子可進入細胞內(nèi)進行進一步的反應。當細胞表面出現(xiàn)較大的破損時，細胞內(nèi)大分子物質(zhì)及內(nèi)容物流失。

本次實驗以口腔科診室環(huán)境作為研究對象，進行了可見光催化納米N-TiO2噴劑抗菌材料在醫(yī)院實際環(huán)境消毒效果的評價研究，可知消毒效果顯著，初步建立了納米N-TiO2噴劑在醫(yī)院環(huán)境消毒的應用方法。但是作為一種新型抗菌劑，目前還未處于研究階段，能否廣泛應用于醫(yī)院中其他科室環(huán)境，還需進一步擴大實驗范圍；此外，能否實現(xiàn)全天候條件下的抗菌效果，還需將噴劑與其他抗菌材料復合得知。