幾丁糖對大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎的療效研究*

張清彬 曹威 吳麗紅 朱明靜 羅倩婷 黎星陽 劉洪臣

顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎是一種由多種因素共同作用導致關(guān)節(jié)軟骨退行性的病變，關(guān)節(jié)軟骨的嚴重磨損和退化變性是其主要病變表現(xiàn)［1，2］。顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（Temporomandibular Disorders，TMD）在臨床上較常見的分類之一，其治療的重點在于如何有效止痛，這同時也是一個重要的研究和發(fā)展方向?；ぱ椎呐R床治療中仍然沒有找到一種理想的治療方案，即安全有效、操作簡便且價格低廉、可用于持續(xù)推廣臨床使用的藥物和方法，每種療法都有其一定的局限性。目前臨床中常通過在患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉以有效減輕滑膜炎患者的關(guān)節(jié)疼痛癥狀［3，4］。幾丁糖是一種純天然多糖類液態(tài)生物材料，常廣泛應(yīng)用于防治各種關(guān)節(jié)組織術(shù)后的粘連及膝關(guān)節(jié)炎，具有止血、促進創(chuàng)傷愈合、抑制成纖維細胞生長等臨床治療功能［5，6］。然而相比于膝關(guān)節(jié)炎，顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎在臨床上有著不同的臨床發(fā)生與進展及其發(fā)病的機制，幾丁糖能否可以同有效治療膝關(guān)節(jié)炎那樣有效治療及改善顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎的病程進展仍有待進一步研究［7］。因此，本實驗旨在通過在罹患顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎的大鼠的顳下頜關(guān)節(jié)上腔內(nèi)注射幾丁糖以觀察其對顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎的臨床治療作用效果。

1.材料與方法

1.1 動物模型建立及實驗分組 建立顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎的動物模型及注射目標藥物動物實驗在廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院動物實驗室進行［實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0093］。30只9周齡，體重250～300g的清潔級SD大鼠（雄性）購自中國南方醫(yī)科大學動物實驗中心［生產(chǎn)許可證號代碼號：SCXK（粵）2016-0041］，飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度25℃、相對濕度（55%）、人工照明（08∶00～20∶00），喂飼原料為消毒的純凈水和人工消毒的標準普通飼料。將30只大鼠注射卡拉膠用以建立顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎模型，1周后，待動物模型建立成功后將大鼠按照完全隨機分配的方法分為3組，每組各10只，分組治療的具體情況如下：空白組，只行顳下頜關(guān)節(jié)穿刺，不注射藥物；對照組，注射100μL透明質(zhì)酸；實驗組：注射100μL幾丁糖。

麻醉大鼠為在其腹腔注射濃度為30mg/kg的戊巴比妥鈉（濃度為10mg/mL）。在外耳眼眶連線上1mm外耳前2mm處用胰島素注射器向關(guān)節(jié)上腔中注射藥劑。研究中使用的卡拉膠和透明質(zhì)酸濃度均為3%［8］。用32G針頭向兩側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)腔中注入100μL卡拉膠（Sigma，美國）誘導關(guān)節(jié)炎癥。一周后，按照上述方法注射1次幾丁糖及透明質(zhì)酸。藥物注射后1周后抽取關(guān)節(jié)液，注射4周后分別稱重及抽取關(guān)節(jié)液后處死動物。

1.2 動物稱重 動物體重及進食情況分別于實驗前后記錄每只大鼠體重。飼養(yǎng)大鼠時，實驗開始時每籠飼料量為1000g，之后每次每籠均投放1000g，實驗周期結(jié)束時稱量每籠剩余飼料量。

1.3 關(guān)節(jié)液中總蛋白及各種細胞因子的檢測 利用ABC-ELISA試劑盒進行檢測IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的濃度，試劑盒為上海森雄科技實業(yè)有限公司生產(chǎn)和進口分裝的產(chǎn)品，其細胞因子靈敏度均為16pg/mL。對關(guān)節(jié)液中各種總蛋白的細胞因子檢測采用雙金雞寧酸法（bicinchoninic acid，BCA），試劑盒購自一家美國HyClone-PIERCE公司，其靈敏度為20μg/mL。此外，本實驗以IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的蛋白比濃度取代體積比濃度，以減小因不同稀釋度造成的實驗誤差。

1.4 動物處理 安樂死與取材大鼠安樂死采用過量藥物麻醉后斷頭的方法進行，過量麻醉方法為：腹腔注射，100mg/kg，20mg/mL戊巴比妥鈉。安樂死動物后，取每組4只大鼠的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨并用4%多聚甲醛固定4～8h。隨后標本用10% EDTA處理4周后，沖洗、烘干、凝膠固定標本后取出標本，備切片染色。取每組6只大鼠的關(guān)節(jié)軟骨，-80℃保存?zhèn)溆?，用于RT-qPCR等分析。

1.5 總RNAs提取利用TRIzol（Invitrogen carlsbad，CA）法提取總RNAs完成。將顳下頜關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)軟骨完全分離出來，立即加入液氮研磨成粉，再加入1mL TRIzol試劑。然后依次加入氯仿、異戊醇、70%酒精沉淀RNA。最后通過Nanodrop 2000檢測RNAs濃度和質(zhì)量。

1.6 RT-qPCR檢測相關(guān)因子表達 利用Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser and SYBR Premix Ex Taq（Takara，Dalian，China）進行逆轉(zhuǎn)錄的有機化學反應(yīng)。每個樣本提取1μg總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄。使用熒光定量PCR的方法對Col-2、Acan的基因表達量進行檢測，數(shù)據(jù)內(nèi)參選擇GAPDH。通過比較Ct值法（2-△△Ct法）計算各基因表達量的平均值，利用內(nèi)參將數(shù)據(jù)的平均值標準化。所計算得到的平均值數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

1.7 組織形態(tài)學染色H&E染色采用切片機得到4-5μm切片，貼附于載玻片上，置60℃干燥箱中烘烤2h，然后將切片脫蠟水化，依次將切片放入二甲苯、無水乙醇、85%酒精、75%酒精、蒸餾水。然后將切片放入蘇木精染液中浸泡5min左右，流動自來水沖洗切片，使用1%的酒精和鹽酸乙醇分化10s，稍后用水洗，促藍液返藍，流水沖洗5min。伊紅染色后中性樹膠進行脫水封片，將切片依次放入95%酒精、無水乙醇、二甲苯，干燥后中性樹膠封片。

1.8 統(tǒng)計學分析 所有統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件，計量數(shù)據(jù)資料組間比較采用單因素方差分析；對于所有符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)資料采用x±s表示，P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

所有實驗動物在觀察期內(nèi)均健康存活，無傷口感染等手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生。動物咀嚼功能正常，在實驗觀察期內(nèi)，動物體重都呈不同程度的持續(xù)穩(wěn)定增加。

2.1 大鼠體重變化 各組大鼠體重及進食飼料量測量實驗前每只大鼠的體重均在250～300g之間，實驗周期結(jié)束處死前稱重，空白組大鼠體重平均增加13.99g。與空白組相比，對照組和實驗組大鼠的正常體重均顯著增加。與對照組相比，實驗組大鼠平均體重增加顯著（見圖1）。

圖1 不同組大鼠體重增加量。空白組平均體重增加13.99g，對照組體重增加87.84g，實驗組體重增加126.47 g。實驗組vs空白組，P＜0.001；實驗組vs對照組，P＜0.001；對照組vs空白組，P＜0.001

實驗周期內(nèi)對三組大鼠的飼料重量進行承重，累加，其中空白組在實驗周期內(nèi)共計進食飼料2570g，對照組3350g，實驗組3520g，其中實驗組大鼠進食量最高。（見圖2）。

圖2 不同組大鼠進食量

2.2 關(guān)節(jié)液中相關(guān)炎癥因子的檢測 抽取每只大鼠顳下頜關(guān)節(jié)腔中50μL關(guān)節(jié)液。其中空白組10只大鼠關(guān)節(jié)液中蛋白含量為3.19±1.09mg/mL，對照組10只大鼠關(guān)節(jié)液蛋白含量為3.99±2.29mg/mL，實驗組10只大鼠關(guān)節(jié)液蛋白含量為3.09±1.76mg/mL，三組之間蛋白含量均無顯著差異（圖3A）。我們進一步分別檢測3組大鼠關(guān)節(jié)液中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的水平。與空白組相比，對照組和實驗組的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均顯著降低，表明經(jīng)過適當?shù)奶幚砗?，病情炎癥得到控制。與對照組相比，實驗組大鼠的IL-6，IL-8水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義，而TNF-α水平降低無任何統(tǒng)計學意義。

表1 關(guān)節(jié)軟骨合成與分解代謝中各因子的引物

圖3 TMJ總蛋白及炎癥因子檢測。A：總蛋白含量，B：IL-1β蛋白含量，C：IL-6蛋白含量，D：IL-8蛋白含量，E：TNF-α蛋白含量。

2.3 RT-qPCRⅡ型膠原蛋白（Col-2）和蛋白聚糖（Acan）是軟骨細胞細胞外基質(zhì)的主要成分，在軟骨的形成過程中是必不可少的，本實驗結(jié)果顯示實驗組和對照組中Col-2和Acan的mRNA的表達水平顯著提高。此外，實驗組中Col-2和Acan的mRNA表達高于對照組，但無顯著性差異（圖4）。

2.4 H&E檢測 在注射卡拉膠后，空白組、對照組和實驗組均出現(xiàn)了不同程度的滑膜炎病理改變。從大鼠的注射側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)標本縱切片H&E染色樣本中分析可見：空白組中大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨變薄，且關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)、層次變得紊亂，軟骨層和軟骨細胞幾乎完全消失，滑膜組織出現(xiàn)嚴重增厚、折疊樣改變，顳下頜關(guān)節(jié)軟骨及毗鄰組織可見局部炎性細胞浸潤。而對照組和實驗組的關(guān)節(jié)表面表現(xiàn)出輕微的不規(guī)則結(jié)構(gòu)改變，關(guān)節(jié)軟骨層輕度增厚，并且與正常軟骨層厚度相比，軟骨細胞數(shù)量，明顯增加，呈簇狀聚集式分布，而顳下頜關(guān)節(jié)及毗鄰組織局部未見炎性細胞浸潤（圖5）。

圖4 Col-2和Acan基因表達檢測

圖5 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥劑7周后的組織學表現(xiàn)。A：空白組，滑膜嚴重增厚、出現(xiàn)折疊樣改變（×10 ）；B：實驗組：關(guān)節(jié)表面表現(xiàn)出輕微的不規(guī)則改變，關(guān)節(jié)軟骨增厚，軟骨細胞的數(shù)量增加，呈簇狀聚集分布（×10 ）；C：空白組附近組織可見炎性細胞浸潤（×100 ）；D：實驗組附近組織未見炎性細胞浸潤（×100 ）

3.討論

顳下頜關(guān)節(jié)（Temporomandibular Joint，TMJ）結(jié)構(gòu)只存在于哺乳動物中，參與具有咀嚼、吞咽、語言和表情等多種功能的活動［9］。顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎發(fā)生后往往首先引起患者出現(xiàn)的是顳部疼痛，可能還伴有頭暈、耳鳴等癥狀［10］。TMJ滑膜是TMJ滑動運動體系中的重要組成部分之一，是一層薄而柔軟、光滑的疏松結(jié)締組織，襯于關(guān)節(jié)囊內(nèi)表面，覆蓋于關(guān)節(jié)盤之上，其邊緣附著于顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的外周緣，將整個關(guān)節(jié)腔包繞形成一個密閉的關(guān)節(jié)囊結(jié)構(gòu)［11］。這些滑膜既能分泌滑液以潤滑關(guān)節(jié)，減少與關(guān)節(jié)表面的摩擦，防止關(guān)節(jié)表面的粘連，同時又能為關(guān)節(jié)軟骨組織提供足夠的營養(yǎng)成分及幫助排泄廢物等［12］。TMJ滑膜及關(guān)節(jié)囊的炎癥反應(yīng)與TMD的關(guān)節(jié)炎癥病生理變化過程有著直接的聯(lián)系，主要引起包括急、慢性TMJ滑膜炎、TMJ關(guān)節(jié)囊炎等疾病。此外，TMJ炎癥通常還會伴有顳下頜關(guān)節(jié)盤移位、骨關(guān)節(jié)病以及骨關(guān)節(jié)炎。

TMJ滑膜炎是臨床上常見的一種慢性口腔頜面部關(guān)節(jié)疾病，是TMJ紊亂病的一個重要亞類，是老年人口腔疾病中的一種常見病、多發(fā)病，僅次于牙周病、齲?。?3］。TMJ滑膜炎在臨床上主要包括滑膜炎和關(guān)節(jié)囊炎兩大類?；ぱ滓话闶侵富ぴ趧?chuàng)傷、感染、骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)退行性變、手術(shù)等各種狀況下發(fā)生的炎性化學反應(yīng)，使滑膜細胞正常的分泌功能失調(diào)從而導致關(guān)節(jié)積液的一種關(guān)節(jié)局部性病變。其臨床癥狀表現(xiàn)為隨關(guān)節(jié)功能性活動以及向上、后方向的活動關(guān)節(jié)受到負重壓力而出現(xiàn)加重的關(guān)節(jié)局部性疼痛，嚴重影響患者的工作和日常生活，令患者十分痛苦。迄今為止，臨床上對于關(guān)節(jié)炎的治療雖然種類繁多［14］，卻仍然沒有找到一種安全有效、操作簡便、價格低廉的治療方法。此外，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機制也鮮有報道［15］。

Horton首次采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射氫化可的松治療顳下頜關(guān)節(jié)疼痛，隨后，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素逐漸成為臨床上治療顳下頜關(guān)節(jié)疼痛的一種常用方法［16］。其作用機制主要是抗炎和免疫抑制。而近年來的臨床研究進一步證明，關(guān)節(jié)腔內(nèi)進行注射糖皮質(zhì)激素可能直接誘發(fā)關(guān)節(jié)相關(guān)組織如關(guān)節(jié)盤、軟骨以及髁突的損失和破壞。因此，臨床上逐漸使用透明質(zhì)酸鈉等藥物替代激素注射進行治療［15，17］。透明質(zhì)酸存在于關(guān)節(jié)液及軟骨基質(zhì)中，是重要的組成成分之一，能夠有效在關(guān)節(jié)腔內(nèi)起到潤滑作用、并維持關(guān)節(jié)液的黏性和流動性，同時能夠參與細胞外基質(zhì)中磷酸電解質(zhì)及其水分調(diào)節(jié)，具有提供營養(yǎng)軟骨參與促進軟骨組織修復等多種重要生理功能。由于透明質(zhì)酸在保護、營養(yǎng)關(guān)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，后來被越來越廣泛地應(yīng)用于關(guān)節(jié)腔注射，與此同時關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸后引發(fā)的治療后關(guān)節(jié)腔黏連也逐漸引起了廣大口腔醫(yī)生及學者的注意［18，19］。迄今為止，在用于關(guān)節(jié)腔注射的主要藥物研究和選擇中，始終未能發(fā)現(xiàn)一種既能補充營養(yǎng)、潤滑關(guān)節(jié)，又能對機體無不良反應(yīng)產(chǎn)生的理想藥物。幾丁糖是由甲殼動物外殼中提取的一種高分子化合物，可被體內(nèi)細胞存在的溶酶菌等其他化學物質(zhì)降解成低分子殼寡糖和高分子葡萄糖胺。殼寡糖對機體具有良好的免疫調(diào)節(jié)、廣譜抑菌、抑制成纖維細胞生長、促進上皮細胞生長等多種生物學特性。所以本法不良反應(yīng)小，易于臨床操作［20］。目前，臨床上已廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)、盆腔、腹腔、肌腱及神經(jīng)手術(shù)中，可有效預防術(shù)后組織粘連，促進術(shù)后止血和創(chuàng)面愈合，促進關(guān)節(jié)軟骨修復［21］。目前幾丁糖在大關(guān)節(jié)疾病的治療中已得到廣泛應(yīng)用，但是鑒于顳下頜關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)及發(fā)病病因的復雜性，幾丁糖在顳下頜關(guān)節(jié)中的治療效果及機制仍有待深入研究。隨著顳下頜疾病，特別是顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎的患病率在臨床診療中不斷攀升，顳下頜疾病的治療也逐漸引起越來越多學者、醫(yī)生以及廣大患者的重視。

目前動物實驗中被研究人員普遍接受的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎建模方法有以下幾種：方法一是改變大鼠前牙咬合［22］，方法二是外科手術(shù)損傷大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜［23］，方法三是大鼠關(guān)節(jié)腔注射藥物，常用卡拉膠［8］。以上三種方法在科研中具有廣泛的應(yīng)用，方法一中在大鼠上前牙粘接具有一定形態(tài)的金屬冠來改變大鼠咬合，同時也影響大鼠的正常咀嚼；方法二中在使用外科方法損傷大鼠滑膜時，由于大鼠顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)較小，外科損傷往往不只損傷滑膜，滑膜下軟骨，甚至骨組織亦損傷，本實驗中旨在討論關(guān)節(jié)滑膜炎，不牽涉骨關(guān)節(jié)炎，綜上所述，本研究選擇卡拉膠關(guān)節(jié)腔注射方法用以建立大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎模型，操作簡單，并且已排除干擾實驗結(jié)果的其他變量。本研究在成功構(gòu)建大鼠TMJ滑膜炎模型后，分別向?qū)φ战M和實驗組注射透明質(zhì)酸和幾丁糖，空白組只進行關(guān)節(jié)腔穿刺，不注射藥物。與對照組相比，實驗組大鼠進食量較大，體重顯著增加，幾丁糖和透明質(zhì)酸均可以降低IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平。從進食量及體重水平可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過藥物注射治療后的大鼠具有更大的進食欲望，說明對照組與實驗組大鼠的TMJ滑膜炎癥狀較空白組改善，同時相關(guān)炎癥因子的表達水平在兩治療組中均表達下調(diào)。對照組與實驗組對比，實驗組中IL-6的表達情況比對照組明顯下調(diào)，而IL-1β、IL-8及TNF-α表達水平并無統(tǒng)計學差異。IL-6是TMD發(fā)病過程中的主要促炎細胞因子，在炎癥過程與TMJ結(jié)構(gòu)破壞之間的聯(lián)系已被闡明［24，25］。IL-6是急性炎癥向慢性轉(zhuǎn)化的必需元素，在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中具有雙重影響。有學者研究發(fā)現(xiàn)［26］，在人類TMJ患者中IL-6血漿濃度可在組織損傷發(fā)生后60分鐘內(nèi)確定，峰值范圍為4至6小時至10天。我們對大鼠取材時間在第四周，已經(jīng)超過IL-6的表達峰值時間，因此兩治療組IL-6的表達水平已經(jīng)明顯下降，說明兩種藥物對TMJ滑膜炎均具有一定的治療作用。而實驗組具有更低的IL-6表達水平，說明與透明質(zhì)酸鈉對比，幾丁糖能更好地減輕炎癥因子對TMJ的影響。IL-8在TMJ疾病的發(fā)病機理中也具有一定功能［27］，幾丁糖也可以有效降低關(guān)節(jié)液中IL-8的水平。TNF-α是炎癥階段早期即升高的細胞因子，可以影響許多炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生［28，29］，IL-1β則具有促炎作用［30］。由于取材時間為第4周取材，治療組大鼠滑膜炎可能已被治愈，引起炎癥反應(yīng)的前期炎癥因子表達已不明顯。

兩個治療組Col-2和Acan的基因表達水平高于對照組。在對關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)學的臨床觀察中可以發(fā)現(xiàn)，對照組和實驗組大鼠的注射側(cè)關(guān)節(jié)表面僅表現(xiàn)出輕微的不規(guī)則的組織結(jié)構(gòu)改變，關(guān)節(jié)軟骨明顯增厚，并且與正常關(guān)節(jié)軟骨相比，軟骨細胞的數(shù)量增加，呈簇狀聚集分布，而顳下頜關(guān)節(jié)及毗鄰組織未見炎性細胞浸潤。這說明，在第4周的時候，兩種藥物均能成功改善大鼠TMJ滑膜炎癥狀并能保護關(guān)節(jié)軟骨不被破壞。我們的實驗結(jié)果證實，幾丁糖與透明質(zhì)酸鈉療效類似，在第四周時均能治愈大鼠TMJ滑膜炎。但是由于取材時間偏晚，實驗觀測時間點不足，我們未能在治療全過程中觀測兩種藥物的治療效果。

綜上所述，本實驗進一步證實了幾丁糖注射治療可有效地降低大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎模型中的IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的表達水平，與透明質(zhì)酸鈉的治療效果對比，其能更好地減低IL-6，IL-8炎癥因子的表達水平。然而，由于顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎疾病自身的復雜性，同時幾丁糖用于治療大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎的作用機制以及長期療效尚不明確，我們將繼續(xù)致力于顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎可能的發(fā)病機制的研究，并進一步探討幾丁糖用于人顳下頜關(guān)節(jié)治療的長期療效。