苦參堿急性毒性試驗(yàn)及對小鼠血液生理生化指標(biāo)影響

吳海港 ， 張夢瑤 ， 胡玉妍 ， 陳瀟欽 ， 劉 佳 ， 劉錦妮 *

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南信陽 464000；2.信陽市獸藥新制劑研發(fā)與創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，河南信陽 464000）

苦參堿是從豆科的槐屬、野決明屬及山豆根屬等植物提取的生物堿。苦參堿具有多種生物活性，對機(jī)體多種器官具有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)具有抗寄生蟲、抗細(xì)菌、抗真菌及抗病毒等藥理作用（吳富鑫等，2019；張明發(fā)等，2018），在畜牧生產(chǎn)中具有廣泛的推廣應(yīng)用價(jià)值。冷曉紅（2013）、韓歡勝等（2017）采用苦參堿治療奶牛乳房炎取得了較好的臨床效果。胡安君等（2016）報(bào)道苦參堿對PRRSV有顯著抑制作用，可用于豬繁殖與呼吸障礙綜合征的治療。 Raza（2015）和 Kostadinovic等（2015）使用苦參堿治療家禽新城疫及球蟲病，治療效果顯著。

苦參堿在眾多方面具有較好的生物活性，但是一些研究發(fā)現(xiàn)大劑量使用苦參堿可能引起中毒癥狀，主要以急性肝毒性、神經(jīng)毒性、胃腸道反應(yīng)為主，此外還可引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)毒性等。研究表明，苦參堿可提高中樞神經(jīng)的興奮性遞質(zhì)谷氨酸水平，降低抑制性遞質(zhì)γ-氨基丁酸水平，還可抑制膽堿酯酶活性造成膽堿能神經(jīng)興奮，是引起癲癇樣發(fā)作的生物化學(xué)機(jī)制 （梁培等，2015）。張茜等（2011）試驗(yàn)結(jié)果表明，苦參堿和氧化苦參堿可能對正常的肝細(xì)胞具有一定的毒性作用。楊良月（2015）對綿羊的毒理學(xué)試驗(yàn)表明，大劑量使用苦參堿可造成肺臟、肝臟、腦、腎臟和心臟損傷。因此，開展苦參堿安全性評(píng)價(jià)對苦參堿在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用推廣至關(guān)重要。本試驗(yàn)對苦參堿的急性毒性及對血液生理生化指標(biāo)影響進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，為下一步苦參堿的推廣和研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 小鼠，雌雄各半，96只，體重（25±2）g，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于信陽農(nóng)林學(xué)院養(yǎng)殖基地，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水，室溫（22±2）℃，濕度（70±5）%。

1.2 主要藥品與設(shè)備 苦參堿 （含量≥98%，陜西滕邁生物科技有限公司提供）；邁瑞B(yǎng)C-2600全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀 （武漢凱典瑞醫(yī)療科技有限公司）；Animal-3000型動(dòng)物生化分析儀 （濟(jì)南格利特科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 半數(shù)致死量的測定 預(yù)試驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)室中，將溫度控制在（22±2）℃，試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)提前禁食 12 h，禁水2 h。然后，取小鼠20只，隨機(jī)平均分成5組，分別按不同劑量灌胃給藥，給藥后，給予其正常飲水和進(jìn)食，確定其絕對致死劑量與最大耐受劑量，為正式試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

正式試驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)室中，將溫度控制在（22±2）℃，試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)提前禁食12 h，禁水2 h。然后，取小鼠40只，隨機(jī)平均分5組，根據(jù)一定的組間劑量比，每組按一定的劑量采用灌胃給藥。給藥后，給予其正常飲水和進(jìn)食，并連續(xù)觀察5 d。隔一定時(shí)間觀察并記錄小鼠的癥狀、生理狀態(tài)和死亡情況，根據(jù)每組死亡數(shù)量，最后算出半數(shù)致死量（改良寇氏計(jì)算法）。

1.3.2 血常規(guī)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)的測定 選用健康、體重均勻的小鼠36只，隨機(jī)均分成4組，根據(jù)半數(shù)致死量結(jié)果，分高、中、低（5、2、0.5 mg/mL）三個(gè)劑量組對小鼠進(jìn)行灌胃給藥，對照組以等量生理鹽水進(jìn)行灌胃。每天給藥一次，每次每只灌胃0.5 mL，連續(xù)灌胃14 d。每天觀察并記錄小鼠健康狀況，活動(dòng)、采食、飲水、排泄物、發(fā)病和死亡等。分別于第7天和第14天采用眼眶采血法進(jìn)行采血，進(jìn)行血液生理和生化檢測。

檢驗(yàn)項(xiàng)目包括：紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、血紅蛋白（HGB）、血小板總數(shù)（PLT）等血常規(guī)指標(biāo)和丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALKP）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）、總蛋白（TP）、血糖（GLU）等血液生化指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 急性毒理試驗(yàn)結(jié)果 小鼠試驗(yàn)觀察結(jié)果表明，高劑量組（500 mg/kg）灌胃 3 min后，神經(jīng)癥狀，四肢無力，精神不濟(jì)，出現(xiàn)抽搐倒地，全身震顫；約5 min后全部死亡。350、245、171.5 mg/kg劑量組小鼠灌胃后3～5 min均出現(xiàn)肌肉抽搐，亂跑亂跳，痙攣，鉆地扎堆等現(xiàn)象。120.05 mg/kg劑量組灌胃給藥后出現(xiàn)輕微神經(jīng)癥狀，輕度肌肉抽搐，精神沉郁，身體蜷縮，鉆地扎堆，約2 h后精神恢復(fù)正常，未有死亡狀況出現(xiàn)（表1）。未死亡小鼠1 d后精神活動(dòng)均恢復(fù)正常?？鄥A經(jīng)口灌服半數(shù)致死量LD50為245.0191 mg/kg，其95%置信區(qū)間為201.56 ～297.92 mg/kg。

表1 苦參堿對小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 苦參堿對小鼠血常規(guī)指標(biāo)和血液生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 苦參堿對小鼠血液生理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，給藥7 d后，與對照組相比，各試驗(yàn)組中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中間細(xì)胞和血小板總數(shù)降低，差異顯著（P＜0.05），粒細(xì)胞、紅細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白數(shù)量升高，差異顯著（P＜0.05）。其中中劑量組中各項(xiàng)指標(biāo)升高或者降低程度最為明顯。各試驗(yàn)組相比，中劑量組中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞和中間細(xì)胞數(shù)量顯著低于低劑量組和高劑量組（P＜0.05），而低劑量組和高劑量組中各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。給藥14 d后，各試驗(yàn)組中血小板數(shù)量降低最明顯。低劑量組血液中白細(xì)胞總數(shù)、中間細(xì)胞、粒細(xì)胞顯著高于對照組（P＜0.05），而淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白和血小板總數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05）。 中劑量組血液中各項(xiàng)指標(biāo)顯著低于對照組（P＜0.05）。和第7天相比，低劑量組中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中間細(xì)胞、粒細(xì)胞顯著升高，紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白和血小板總數(shù)顯著降低（P＜0.05），而中劑量組和高劑量組中各項(xiàng)生理指標(biāo)總體呈降低趨勢。

2.2.2 苦參堿對小鼠血液生化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，給藥7 d后，中劑量組和高劑量組中ALKP、UREA、TP含量較對照組顯著增高 （P＜0.05），其中高劑量組中ALKP和TP分別是對照組的1.96倍和2.18倍。ALT和GLU含量低于對照組，差異顯著（P＜0.05）。低劑量組中除CREA和TP外，其他各項(xiàng)指標(biāo)顯著降低（P＜0.05）。各試驗(yàn)組相比，中劑量組中各項(xiàng)指標(biāo)變化最為明顯。給藥14 d后，各試驗(yàn)組中ALKP和GLU含量顯著低于對照組（P＜0.05），低劑量組和中劑量組中ALT、UREA、CREA、TP 的 含量 顯著升高 （P ＜0.05）。各試驗(yàn)組相比，高劑量組中各項(xiàng)指標(biāo)呈下降趨勢，其中ALKP和CREA含量差異顯著（P＜0.05）。 和第 7天相比，血清中 ALKP、GLU、TP 呈下降趨勢，ALT、CREA、UREA呈升高趨勢。

表2 苦參堿對小鼠血液生理指標(biāo)的影響

表3 苦參堿對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

3 討論

急性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥物及其制劑安全性的重要指標(biāo)，可以根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果判斷藥物的毒性大小及其作用的靶器官，并且為亞急性、慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)。LD50是評(píng)價(jià)急性毒性的重要指標(biāo)。楊良月等（2015）報(bào)道，苦參堿小鼠灌胃的LD50為570.26 mg/kg，其95%置信區(qū)間為487.45 ～ 635.78 mg/kg。 張宏利等（2005）研究表明，苦參堿小鼠灌胃的LD50為64 mg/kg。貝宇飛等 （2012）對小鼠腹腔注射苦參堿得出的LD50為92.56 mg/kg。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，苦參堿小鼠灌胃的LD50為 245.0191 mg/kg，其 95%置信區(qū)間為201.5580～297.9202 mg/kg。表明藥物L(fēng)D50大小與給藥途徑、劑型、藥物純度等因素有關(guān)。此外，本試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)小鼠灌服苦參堿后，大部分小鼠會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)直性痙攣，肌肉震顫等毒性反應(yīng)，時(shí)而會(huì)出現(xiàn)上竄下跳，身體蜷縮，喜扎堆等反應(yīng)，可見苦參堿毒性會(huì)作用于神經(jīng)系統(tǒng)。這與田雪松等（2016）報(bào)道結(jié)果相一致，其原因可能是由于大量使用苦參堿后，會(huì)抑制體內(nèi)膽堿酯酶的活性。

血液生理指標(biāo)、生化指標(biāo)是評(píng)價(jià)機(jī)體和組織器官病變的重要指標(biāo)。丙氨酸轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶是評(píng)價(jià)肝是否損傷的指標(biāo)，肌酐和尿素是評(píng)價(jià)腎是否損傷的指標(biāo)?？偟鞍?、血糖可反映體內(nèi)蛋白質(zhì)含量與血液中葡萄糖濃度（戴五好等，2015）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用苦參堿能夠提高血液中紅細(xì)胞、粒細(xì)胞的數(shù)量，減少血小板總數(shù)，且與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)，與用藥次數(shù)呈正相關(guān)。此外，剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)組織中有大量充血和出血現(xiàn)象，表明苦參堿產(chǎn)生的毒性反應(yīng)會(huì)引起小鼠體內(nèi)產(chǎn)生炎癥或局部感染，這和宋兵（2009）、劉學(xué)楠等（2019）報(bào)道的苦豆子提取物的毒性相似。 研究表明，苦參堿能夠顯著升高血清ALT、AST含量，降低SOD、MDA、GSH 含量，導(dǎo)致肝毒性（郭秋平，2016；李素君，2011）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥7 d后，中劑量組和高劑量組中 ALKP、UREA、TP含量顯著增高，ALT和GLU含量呈下降趨勢，而給藥14 d后，各試驗(yàn)組中ALKP和GLU含量下降，ALT、UREA、CREA、TP的含量升高。表明苦參堿能夠引起肝臟和腎臟毒性，其呈現(xiàn)毒性-時(shí)間-濃度正相關(guān)。這與李素君（2011）的試驗(yàn)結(jié)果相一致，說明苦參堿毒性靶器官主要是肝臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)。其毒性機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，苦參堿經(jīng)口灌服半數(shù)致死量 LD50為 245.0191 mg/kg，其 95%置信區(qū)間為201.5580～297.9202 mg/kg，屬中等毒性物質(zhì)?？鄥A能夠升高血液中紅細(xì)胞、粒細(xì)胞的數(shù)量，降低血小板總數(shù)。 血清中 ALKP、GLU、TP、ALT、CREA、UREA總體呈現(xiàn)升高趨勢，且與藥物劑量、給藥時(shí)間呈正相關(guān)。