C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎模型的建立*

練高建 楊神書(shū) 何理平 尹倩梅 譚翔文 吳端生 蘇澤紅

(1.南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，衡陽(yáng) 421001)(2.南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)系，衡陽(yáng) 421001)

人類(lèi)多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis, MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性浸潤(rùn)，脫髓鞘，軸突損害及腦萎縮為主要特征的一種復(fù)雜基因疾病。很多研究證明MS的發(fā)生具有很強(qiáng)的基因背景[1-3]；自身的激活反應(yīng)性T細(xì)胞也參與調(diào)節(jié)多發(fā)性硬化癥的病理生理學(xué)進(jìn)程。目前光學(xué)相干斷層成像掃描技術(shù)(optical coherence tomography, OCT)已應(yīng)用于MS病理組織觀察[4]，但MS的發(fā)病機(jī)理仍不清楚。

實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimental Allergic Encephalomyelitis, EAE)是由針對(duì)CNS髓鞘發(fā)生免疫攻擊的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，抗原致敏的T細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞，誘發(fā)對(duì)自身髓鞘抗原的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腦及脊髓的免疫損傷。EAE是人類(lèi)MS的經(jīng)典模型，通過(guò)對(duì)EAE發(fā)病機(jī)制、病情發(fā)生發(fā)展規(guī)律、臨床及病理改變、治療及預(yù)防等方面的深入研究，可為MS的治療提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[5]。

因此，本文以C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在國(guó)內(nèi)外使用的方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，成功建立起病程穩(wěn)定、發(fā)病率高的EAE模型，為研究人類(lèi)MS的發(fā)病機(jī)理及篩選有效的臨床防治藥物提供可靠的小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)7～9周雄性C57BL/6小鼠(16～20 g)，購(gòu)自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。所有小鼠均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，隨機(jī)分為EAE模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，每組10只。

1.2 試劑

髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白MOG35-55多肽(Myelin Oligodendrocyte glycoprotein (MOG) 35-55 peptide)購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，預(yù)先用PBS配制成10 mg/mL，儲(chǔ)存于-20 ℃，工作濃度：0.5 mg/mL。百日咳毒素(已滅活)(Pertussis toxin, PTX)購(gòu)自北京博蕾德生物科技有限公司，預(yù)先用PBS配制成100μg/mL，儲(chǔ)存于-20 ℃，用前用PBS稀釋100倍，腹腔注射0.2 mL/只。結(jié)核分支桿菌(已滅活)(Mycobacteriumtuberculosis, MT)購(gòu)自西寶生物科技(上海)股份有限公司。不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s Adjuvant，IFA)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，預(yù)先準(zhǔn)備4 mg/mL MT-IFA混合液：80 mg 結(jié)核分支桿菌與20 mL不完全弗氏佐劑充分混勻后，轉(zhuǎn)移至50 mL玻璃勻漿器，按照10 min反復(fù)研磨，然后置于冰上10 min的節(jié)奏，至少重復(fù)3遍以上(注意：準(zhǔn)備時(shí)應(yīng)戴上口罩)。

MOG33-35與MT-IFA混合液的準(zhǔn)備：先用一支注射器吸取0.5 mg/mL的MOG33-35工作液，另一支注射器吸取與MOG33-35工作液等體積的MT-IFA工作液，小心地去除2支注射器中的空氣后，用3向旋塞閥連接2支注射器(根據(jù)混合體積選擇合適的注射器)，反復(fù)抽打5 min，然后置于-20 ℃ 5～10 min，如此反復(fù)3次以上直至形成混合良好的油包水型乳化劑。

1.3 EAE的構(gòu)建

將小鼠麻醉后，先以0.2 mL/只小鼠的劑量腹腔注射準(zhǔn)備好的1 μg/mL的百日咳毒素工作液，然后每只小鼠注射0.2 mL上述方法準(zhǔn)備好的MOG-MT-IFA抗原混合液，背部約前肢肩胛骨及后肢髖關(guān)節(jié)部位分4點(diǎn)皮下注射各50 μL。于48 h后再每只小鼠分別腹腔注射1μg/mL的百日咳毒素工作液0.2 mL。對(duì)照組小鼠僅注射PBS。

1.4 EAE進(jìn)程監(jiān)測(cè)及臨床癥狀分級(jí)

自第2次注射百日咳毒素后，每日觀察小鼠狀態(tài)。采用雙盲法，按照Goverman等[6]提出的標(biāo)準(zhǔn)判斷小鼠發(fā)病程度：0分，小鼠各項(xiàng)指標(biāo)正常；1分，尾無(wú)力及下垂；2分，步態(tài)不穩(wěn)，人為翻身后不能迅速?gòu)?fù)位；3分，后肢無(wú)力或單側(cè)后肢癱瘓；4分，后肢拖行，完全癱瘓；5分，后肢完全癱瘓伴隨前肢無(wú)力或癱瘓。

1.5 取材及組織學(xué)分析

EAE小鼠發(fā)病至高峰期，用異氟烷深度麻醉小鼠，打開(kāi)小鼠胸腔，用注射器經(jīng)左心室灌注PBS至肝臟發(fā)白，取出脊髓，用10%多聚甲醛固定，6 μm石蠟切片，經(jīng)常規(guī)蘇木素-伊紅(H&E)染色，或神經(jīng)髓鞘固藍(lán)(Luxol fast blue,LFB)/過(guò)碘酸雪夫氏(Periodic Acid-Schiff, PAS)雙重染色，或免疫組織化學(xué)染色后，光鏡下觀察分析炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，脫髓鞘狀況及鑒定浸潤(rùn)炎性細(xì)胞類(lèi)型。

2 結(jié)果

2.1 EAE發(fā)生發(fā)展情況

自抗原免疫后第10天起，EAE實(shí)驗(yàn)組小鼠開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)EAE臨床癥狀，至15 d達(dá)到發(fā)病高峰，發(fā)病率達(dá)到100%。EAE實(shí)驗(yàn)組小鼠發(fā)病后表現(xiàn)為：行動(dòng)遲緩，活動(dòng)減少，食欲下降伴隨體質(zhì)量減輕，身體狀態(tài)明顯差于對(duì)照組小鼠。臨床癥狀則隨時(shí)間的推移逐漸加重，具體表現(xiàn)為：從尾巴松弛下垂開(kāi)始，至步態(tài)搖擺、人為翻身不能自主快速?gòu)?fù)位，再進(jìn)至單側(cè)后肢癱瘓、雙后肢癱瘓，最終發(fā)展為四肢癱瘓。 而對(duì)照組所有動(dòng)物至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)表現(xiàn)正常，狀態(tài)良好，未出現(xiàn)發(fā)病情況，且小鼠體質(zhì)量正常增加。按照動(dòng)物福利規(guī)定要求，我們的實(shí)驗(yàn)最高評(píng)分為4分，動(dòng)物達(dá)到4分標(biāo)準(zhǔn)后即麻醉處死取材分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1 C57BL/6小鼠神經(jīng)功能評(píng)分Fig.1 Neural function score of C57BL/6 mice

2.2 HE 結(jié)果

小鼠腦脊髓組織HE染色結(jié)果顯示，模型組(圖2 A)中出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其以腰部脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最為嚴(yán)重。而正常對(duì)照組(圖2B)則未發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 HE 染色顯示脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn) (×100)注： A. EAE組；B. 正常對(duì)照組Fig.2 Inflammatory cells infiltration in spinal cord, HE staining (×100)Note：A. EAE group; B. Control group

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

為進(jìn)一步確定浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞的類(lèi)型，我們分別進(jìn)行了淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的免疫組化染色反應(yīng)研究，結(jié)果顯示，模型組浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞中，少量為淋巴細(xì)胞，大部分為巨噬細(xì)胞(圖3A)，而正常對(duì)照組(圖3B)則沒(méi)有出現(xiàn)任何炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖3 免疫組化反應(yīng)顯示脊髓中浸潤(rùn)細(xì)胞類(lèi)型 (×100)注：A. EAE組；B. 正常對(duì)照組Fig.3 Inflammatory cells infiltration in spinal cord, Immunohistochemistry assay (×100)Note：A. EAE group; B. Control group

2.4 LFP/PAS 雙重染色結(jié)果

為同時(shí)表現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘病理變化，我們進(jìn)行了LFP/PAS雙重染色反應(yīng)，結(jié)果顯示，模型組出現(xiàn)明顯的細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘病理改變(圖4中箭頭所示)，而正常對(duì)照組則無(wú)此現(xiàn)象發(fā)生。

圖4 神經(jīng)髓鞘固藍(lán)(LFB)/過(guò)碘酸雪夫氏(PAS)雙重染色顯示脊髓中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘狀況 (×100)注： A. EAE組；B. 正常對(duì)照組Fig.4 Inflammatory cells infiltration and demyelination in spinal cord, LFB/PAS double staining (×100)Note：A. EAE group; B. Control group

3 討論

雖然至今仍然未能闡明MS的發(fā)病機(jī)理，但大量的研究表明，髓鞘特異性的TH17細(xì)胞過(guò)度的免疫反應(yīng)以及具有免疫耐受作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能紊亂，在MS的病理進(jìn)程中扮演了重要角色。TH17 cells 對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)和在外周免疫器官的累積，及其特征性細(xì)胞因子-IL-17通過(guò)不同的作用機(jī)制也對(duì)MS及EAE的病理進(jìn)程起了極大的作用[7-8]。因此，建立起能準(zhǔn)確模擬MS發(fā)病過(guò)程并具有類(lèi)似臨床表現(xiàn)的動(dòng)物模型，能為闡明MS的發(fā)病機(jī)制及篩選防治MS的有效藥物打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

不同品種或同一品種不同品系動(dòng)物對(duì)EAE的易感性主要受免疫反應(yīng)基因(Ir基因)影響，Ir基因的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞表面受體對(duì)髓鞘堿性蛋白(MBP)的特異性表達(dá)。動(dòng)物的種類(lèi)不同，其受體表達(dá)能力不同，對(duì)自身抗原的反應(yīng)性不同，因而對(duì)EAE的易感性也不同，因此在選擇動(dòng)物時(shí)需要尋找EAE敏感的模型動(dòng)物。 鑒于對(duì)EAE敏感的Lewis、DA大鼠，PL/J，SJL/J小鼠的價(jià)格昂貴、不易獲得且難以飼養(yǎng)，國(guó)內(nèi)多采用廉價(jià)易得的Wistar大鼠，但其敏感性不及前者。本研究中我們選用的C57BL/6小鼠，在國(guó)內(nèi)應(yīng)用十分廣泛，且遺傳背景明確并早已標(biāo)準(zhǔn)化繁育，使用起來(lái)非常方便且價(jià)格便宜，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。比較起目前國(guó)內(nèi)常用的Wistar大鼠，操作起來(lái)也更為容易。

本實(shí)驗(yàn)采用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白MOG35-55多肽與結(jié)核分支桿菌及不完全弗氏佐劑充分混勻、乳化制成免疫原，以加強(qiáng)免疫原性并延長(zhǎng)抗原在小鼠體內(nèi)的停留時(shí)間，從而充分誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，同時(shí)結(jié)合2次腹腔注射百日咳毒素，以利于炎性細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，成功建立起的EAE小鼠模型，不僅模型穩(wěn)定，病理上則表現(xiàn)出炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其是以巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主，并出現(xiàn)明顯的脫髓鞘現(xiàn)象，這些表現(xiàn)均與人類(lèi)多發(fā)性硬化癥極為相似。而且發(fā)病率高達(dá)100%，從而在實(shí)驗(yàn)中可以排除模型構(gòu)建成功與否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，方便對(duì)所篩選的藥物是否有效或療效如何作出準(zhǔn)確判斷。因此，值得在今后的研究中進(jìn)一步探討，并將其應(yīng)用于MS發(fā)病機(jī)理及預(yù)防治療的課題研究中。