如何提高病毒外源因子檢測(cè)中小鼠和乳鼠檢查法的成功率

馮學(xué)軒 鐘志勇 嚴(yán)家榮 黎莉斯 鄺少松

(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 528248)

隨著醫(yī)藥研究的發(fā)展，生物制品在臨床上的使用率日趨上升，且應(yīng)用范圍日益廣泛，在使用頻率和使用人群不斷上升的情況下，安全性問題隨之而來。生物制品大多使用動(dòng)物血清、細(xì)胞基質(zhì)、蛋白酶等進(jìn)行選育、培養(yǎng)，且生產(chǎn)過程中人工操作等影響因素較多，因此十分容易受到外源的病毒、微生物，包括細(xì)菌、真菌、支原體、螺原體、分枝桿菌、立克次氏體、原生動(dòng)物、寄生蟲、朊粒及病毒(包括細(xì)胞系/株本身攜帶的逆轉(zhuǎn)錄病毒和外界污染的病毒)等的污染[1-2]，且一旦受污染的制品流于臨床，容易導(dǎo)致使用者出現(xiàn)生命危險(xiǎn)，或引發(fā)流行性疾病，后果不堪設(shè)想。因此，對(duì)于生物制品，如病毒類制品，細(xì)胞制品等的安全性均要進(jìn)行嚴(yán)格的把控。

目前，無論是WHO、歐盟、美國(guó) FDA，還是我國(guó)藥典，均對(duì)疫苗外源病毒污染檢測(cè)和控制有嚴(yán)格要求[3]。2015年版中國(guó)藥典三部通則里，也參照歐洲藥典對(duì)外源因子的檢測(cè)作了規(guī)定[1]。但規(guī)定中的一些細(xì)節(jié)問題及操作方法也未作明確描述，加上病毒類外源因子感染細(xì)胞后短期內(nèi)無明顯特征，因此肉眼難以分辨，若在外源因子的檢測(cè)過程中操作不當(dāng)，或者供試品給予劑量不準(zhǔn)確等，則將容易導(dǎo)致假陰性或假陽性的結(jié)果[4]。

在外源因子的檢測(cè)方法中，對(duì)于小鼠法和乳鼠法，筆者通過多次的驗(yàn)證、探討，對(duì)于如何提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及成功率，具有一定的心得，特作以下的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。

1 供試品的前處理

取樣時(shí)應(yīng)遵循隨機(jī)、足量及最大限度暴露毒性的原則。具體可參照2015版中國(guó)藥典三部通則3302關(guān)于供試品制備原則的相關(guān)要求。若受試樣品為細(xì)胞或細(xì)胞上清液，細(xì)胞應(yīng)盡量在原單位生產(chǎn)后盡快接種，細(xì)胞上清液則采用原液接種，無特殊情況，盡量不作稀釋[5]。

2 小鼠法和乳鼠法中腦內(nèi)接種的方法

小鼠法和乳鼠法均需要腦內(nèi)接種與腹腔接種，其中腦內(nèi)接種方法難度稍大，接種時(shí)是否漏液，會(huì)否影響動(dòng)物的存活率等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷有著至關(guān)重要的影響。

2.1 小鼠腦內(nèi)接種操作方法的選擇

小鼠腦內(nèi)接種時(shí)，常用兩種方法，一種方法是從眼窩后方，眼角處往斜上方進(jìn)針，有落空感后停止進(jìn)針，注射藥液；另一種方法是從兩眼連線的正中間垂直進(jìn)針，刺破頭骨后停止進(jìn)針，注射藥液。有文獻(xiàn)報(bào)道第一種方法對(duì)小鼠影響較小，但個(gè)人實(shí)踐后發(fā)現(xiàn)，第一種方法由于各鼠間的進(jìn)針深度受每次操作時(shí)進(jìn)針的角度、力度等影響，即便同一人操作，也難以做到操作上的一致性，由此導(dǎo)致各鼠間在給藥過程中就存在著較大差異。筆者曾嘗試在針柄處套上橡膠套以固定進(jìn)針深度，但每只動(dòng)物體型上的差異會(huì)導(dǎo)致其進(jìn)針深度存在一定的個(gè)體差異，因此最適宜的進(jìn)針深度并非完全一致。此外，此法的進(jìn)針深度較大，且進(jìn)針后，由于針頭與顱頂呈一定角度，一旦控制不好，十分容易損傷腦組織，影響動(dòng)物健康。因此，筆者建議采用第二種注射方法：從兩眼連線的正中間垂直進(jìn)針。此法進(jìn)針較淺，且垂直進(jìn)針，操作簡(jiǎn)單，只要針尖斜面沒過頭骨即可注射，加之同一體質(zhì)量段的各鼠顱骨厚度差別較小，因此進(jìn)針深度較為一致，可采用針柄處套橡膠套的方法固定進(jìn)針深度，這樣各鼠間的偏差較小，且對(duì)小鼠顱腦組織影響較小，安全易行。

2.2 小鼠腦內(nèi)接種操作要點(diǎn)

注射時(shí)使用50 μL或100 μL的微量注射器，操作時(shí)需注意：首先，須在針柄上套一橡膠管套以控制每次的進(jìn)針深度，避免力度控制不穩(wěn)，進(jìn)針過深，損傷腦組織，深度一般以沒過針尖斜面1～2 mm即可。其次，捉取動(dòng)物時(shí)，左手拇指與食指從兩耳稍往前捉緊動(dòng)物頭部皮膚以固定頭部，避免動(dòng)物頭部動(dòng)彈而影響注射。此外，注射完畢后，快速直接拔針，不旋轉(zhuǎn)針頭，以免損傷腦組織。拔針后左手兩手指迅速往前推動(dòng)，捏緊注射部位的針口數(shù)秒，以防漏液。最后，注射時(shí)，應(yīng)勻速，且速度切勿過快，以免動(dòng)物因顱內(nèi)壓急劇升高而至死亡，且應(yīng)一次注射完畢，避免二次注射。

2.3 乳鼠腦內(nèi)接種操作要點(diǎn)

乳鼠腦內(nèi)接種時(shí)，針柄同樣需套一橡膠管套以固定進(jìn)針深度，但橡膠管只需固定至針尖斜面上約0.05 mm，不超過1 mm。捉取乳鼠時(shí)，將乳鼠側(cè)臥，自眼睛與耳朵連線中點(diǎn)發(fā)白處進(jìn)針，進(jìn)針深度以沒過針尖斜面約0.05 mm即可，過淺則漏液，過深乳鼠則容易死亡。注射時(shí)也應(yīng)緩慢勻速，避免顱內(nèi)壓急劇升高。注射完畢后同樣直接拔針，并迅速以棉花壓迫注射部位，以免漏液[6]。需注意的是，由于乳鼠較小，且易動(dòng)，注射時(shí)注意固定動(dòng)物及避免針頭動(dòng)彈，必要時(shí)可一人捉取動(dòng)物及固定微量注射器，另一人負(fù)責(zé)緩慢推針。

3 乳鼠試驗(yàn)法中如何避免母鼠吃仔

由于2015版中國(guó)藥典規(guī)定乳鼠試驗(yàn)法中需采用出生24 h內(nèi)的乳鼠，大多數(shù)情況下，由于母鼠剛生產(chǎn)，對(duì)人員及外界環(huán)境較為敏感，一旦受驚嚇，則容易引起母鼠吃仔的情況發(fā)生，且人員操作完畢后，乳鼠身上若殘留有人員的氣味，更容易出現(xiàn)母鼠吃仔的問題。因此，如何防止母鼠吃仔，成為了乳鼠試驗(yàn)法是否成功的關(guān)鍵。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，若需將窩鼠移動(dòng)至實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，則移動(dòng)時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，避免移動(dòng)過程顛簸，移至實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所時(shí)，窩鼠應(yīng)至少適應(yīng)30 min后再行實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)前將少量滅菌后無味的棉花放至窩鼠中，以沾染母鼠氣味，約15 min后，將母鼠與乳鼠分籠。操作時(shí)實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)更換新手套，并用醫(yī)用酒精噴手。注射完后乳鼠可放置于鼠籠的另一角，并用事先放置的棉花與未注射的乳鼠分隔，避免混淆。全部乳鼠注射完畢后，取走棉花，取籠中墊料灑于乳鼠身上，單獨(dú)飼養(yǎng)至少30 min后，再將母鼠與乳鼠合籠，合籠前用酒精棉球在母鼠鼻子上擦拭，以降低母鼠嗅覺的靈敏度，合籠后需觀察一段時(shí)間，若出現(xiàn)母鼠吃仔的情況，則應(yīng)立刻將母鼠與仔鼠分籠，較長(zhǎng)時(shí)間后再按前述方法合籠。在注射不同窩的窩鼠時(shí)，也應(yīng)更換新手套并用醫(yī)用酒精噴手。

以上為筆者在實(shí)驗(yàn)過程中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，僅供參考，望能提高外源病毒因子檢測(cè)的操作可行性與結(jié)果準(zhǔn)確性。