m6A甲基轉移酶復合物在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用研究進展

余夢霞 謝亞萍

到目前為止已有超過150種RNA的轉錄后修飾方式被發(fā)現(xiàn)，其中N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）是最常見的，最早于上世紀70年代被報道。隨后在純化出m6A特異性抗體的基礎上，通過m6A測序、RNA免疫共沉淀等方法，科學家們證實其主要發(fā)生在mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3'untranslated regions,3'UTR）和終止密碼子的特定 RRACH（R：G，A，U；H：U，A，C）序列上。近年來，大量文獻報道m(xù)6A具有調節(jié)mRNA的功能，包括影響轉錄、調控剪切、調節(jié)出核、控制翻譯。此外，m6A在非編碼RNA，包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）、微小 RNA（microRNA,miRNA）、轉運 RNA（transfer RNA,tRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）、細胞內(nèi)小核 RNA（small nuclear RNA，snRNA）等的剪切、加工、成熟過程中也具有重要調節(jié)作用。m6A修飾介導超過80% RNA的甲基化[1]，在各種生理或病理過程中發(fā)揮重要的作用。

正常生理狀態(tài)下，m6A修飾通過甲基轉移酶復合物和去甲基化酶在人體中保持著一種動態(tài)平衡狀態(tài)，而當平衡被打破時就可能導致腫瘤的發(fā)生。到目前為止，科學家們認為m6A的甲基化是由甲基轉移酶復合物協(xié)同完成，而其組成成員包括甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferase like-3,METTL3）、甲基轉移酶樣蛋白 14（methyltransferase like-14,METTL14）、甲基轉移酶樣蛋白 16（methyltransferase like-16,METTL16）、腎母細胞瘤1-結合蛋白（Wilms'tumor 1 associating protein,WTAP）、病毒樣m6A甲基轉移酶相關蛋白（virlike m6A methyltransferase associated protein,VIRMA）、RNA結合基序蛋白15/15B（RNA binding motif protein 15/15B,RBM15/15B）和鋅指CCCH域蛋白13（zinc finger CCCH domain-containing protein 13,ZC3H13）。近年來，越來越多的研究對這類成員的功能進行了探索，本文對m6A甲基轉移酶復合物不同成員在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用相關研究進展作一綜述。

1 METTL3在腫瘤中的作用

METTL3是第一個被識別的m6A甲基轉移酶[1]，早在1997年就被發(fā)現(xiàn)，隨后在不同物種中也相繼鑒定出同源基因，具有多個別稱，如IME4、Spo8或MT-A70，其結構非常保守，提示具有重要功能。人類METTL3基因位于14q11.2，共有10個外顯子?，F(xiàn)有的研究表明METTL3是m6A甲基轉移酶復合物中重要成員，具有RNA甲基化酶活性，在正常生理活動中具有重要調節(jié)作用，而近些年的研究證實在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，METTL3也具有重要調控功能。在膠質母細胞瘤（glioblastoma,GBM）中敲低METTL3可降低去整合素和金屬蛋白酶結構域的跨膜蛋白19（a disintegrin and metalloprotease domain 19,ADAM19）的m6A水平，增強其在膠質瘤干細胞（glioma stem-like cells,GSCs）中的表達，促進GSCs的增殖和自我更新，導致腫瘤的進展[2]，另一研究發(fā)現(xiàn)METTL3通過招募人類抗原R與m6A修飾的SOX2、POU3F2等癌基因的mRNA結合，增強其穩(wěn)定性，促進GBM的進展[3]。在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML）中，METTL3可被轉錄因子 CCAAT/增強子結合蛋白 ζ（CCAAT/enhancer binding protein zeta,CEBPZ）招募至m6A修飾的SP1的啟動子區(qū)，促進SP1的翻譯，激活原癌基因c-Myc，導致AML的發(fā)生、發(fā)展[4]。基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫資料，研究者發(fā)現(xiàn)高表達METTL3是肝癌患者預后不佳的危險因素，而后續(xù)研究證明過表達METTL3可使抑癌基因SOCS2 mRNA的m6A水平升高，被YTH結構域家族蛋白2（YTH domain-containing family protein 2,YTHDF2）識別，誘導降解，引起肝癌的發(fā)生、發(fā)展[5]。在乳腺癌（breast cancer,BC）中，癌基因HBXIP可通過抑制let-7g上調METTL3，而METTL3可反向促進HBXIP表達，從而形成一個正反饋環(huán)路，促進疾病進展[6]。肺癌中有研究發(fā)現(xiàn)β-欖香烯可靶向METTL3的S-腺苷甲硫氨酸結合域，抑制其RNA甲基化酶活性，降低m6A的水平，抑制自噬相關蛋白，如微管相關蛋白1輕鏈3 beta（microtubule associated protein 1 light chain 3 beta,LC3β）、自噬相關蛋白 5（autophagy-related protein 5,ATG5）和自噬相關蛋白7（ATG7），從而發(fā)揮抑癌功能[7]。Li等[8]發(fā)現(xiàn)前列腺癌（prostate cancer，PCa）患者中METTL3往往高表達，RNA甲基化免疫共沉淀測序（methylated RNA immunoprecipitation followed by highthroughput sequencing,MeRIP-seq）和轉錄組測序（RNA sequencing,RNA-seq）明確LHPP與NKX3-1是METTL3的靶基因，敲低METTL3可激活靶基因，抑制蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）通路活性，阻礙腫瘤進展。在口腔鱗癌中，Liu等[9]利用體內(nèi)外實驗證實METTL3可增強多梳家族環(huán)指蛋白4（polycomb group ring finger protein 4,PCGF 4）mRNA的m6A水平，招募胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白1（insulin-like growth factor 2 mrna-binding protein 1,IGF2BP1）穩(wěn)定其 mRNA，促進癌細胞的增殖和轉移。而在胃癌中過表達METTL3可增加pri-miR-17～92的m6A水平，促進DiGeorge綜合征危象區(qū)基因8（DiGeorge syndrome critical region 8,DGCR8）與其結合，誘導剪切成熟，最終激活AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路，導致胃癌發(fā)生。定點突變實驗表明pri-miR-17～92的m6A結合位點中A879最重要[10]。以上研究表明METTL3在腫瘤中具有重要的調控作用，是腫瘤精準治療的潛在靶點。

2 METTL14在腫瘤中的作用

人類METTL14基因位于染色體4q26，共有12個外顯子，與METTL3有43%相似的序列，是m6A甲基轉移酶復合物重要的組件，兩者在核斑上以1∶1的比例形成穩(wěn)定的異二聚體，其中METTL14是RNA結合結構域。在肝癌中高表達METTL14是患者預后良好的因素，機制研究證實過表達METTL14后可促進m6A修飾的pri-miR-126與DGCR8的結合，導致其剪切成熟，繼而抑制肝癌細胞的轉移能力[11]。在GBM中，METTL14可增強ADAM19 m6A的水平，從而抑制GSCs的增殖和自我更新能力[2]。在BC中過表達METTL14可以抑制癌細胞的活性，而利用免疫熒光雜交和RNA pull-down實驗證實lncRNA LNC942的+176～+265序列可與METTL14結合，增加下游靶基因CXCR4和CYP1B1的m6A水平并促進蛋白表達，導致BC進展，反向證明 METTL14的抑癌功能[12]。Ban等[13]發(fā)現(xiàn)METTL14可通過增加頭頸鱗癌患者LNCAROD的m6A水平加強其穩(wěn)定性，促進YBX1和HSPA1A的結合，避免YBX1蛋白被蛋白酶體降解，提高腫瘤細胞的增殖能力。在結腸癌中，Yang等[14]發(fā)現(xiàn)METTL14是低表達的，且與不良預后相關，通過RNA-seq和RNA免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)METTL14可調控lncRNA XIST的m6A水平，促進YTHDF2與其結合并誘導降解，從而發(fā)揮抑癌作用。Gu等[15]在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)METTL14可增加Notch1的m6A水平，降低其穩(wěn)定性從而增強癌細胞的增殖和遷移能力。Weng等[16]研究發(fā)現(xiàn)METTL14在造血干細胞（hematopoietic stem cell,HSC）中高表達，而在其向髓系分化過程中逐漸降低，沉默METTL14可通過抑制下游MYB和MYC兩個靶基因的m6A修飾水平，促進HSC及白血病干細胞向髓系分化，從而抑制AML細胞的增殖。這些結果提示靶向METTL14可能是惡性腫瘤治療的一個新方向。

3 METTL16在腫瘤中的作用

METTL16又稱為METT10D，是一種新識別的m6A甲基轉移酶，主要的作用包括調控腺苷蛋氨酸的水平和對snRNA進行甲基化[17]。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)METTL16在結腸腺癌中高表達，而在直腸腺癌中無表達差異。然而，單因素分析發(fā)現(xiàn)高表達METTL16的直腸腺癌患者總體生存時間（overall survival,OS）顯著延長。Yeon等[19]發(fā)現(xiàn)在結腸癌中METTL16存在移碼突變，但對腫瘤的意義不明。目前有關METTL16的研究有限，需進行更多的探索明確其功能。

4 WTAP在腫瘤中的作用

WTAP又稱為Mum2，其本身沒RNA甲基化的功能，但可起協(xié)調作用，輔助METTL3和METTL14進行m6A修飾。早在2000年，WTAP作為腎母細胞瘤1基因（Wilms'tumor-1,WT1）的協(xié)作因子已被識別，隨后WTAP被發(fā)現(xiàn)在AML中高表達，敲低WTAP后可顯著抑制K562及HL60細胞株增殖，增強依托泊苷的細胞毒反應[20]。而Naren等[21]發(fā)現(xiàn)WTAP蛋白高表達，且與AML更短的OS相關。敲低WTAP可降低c-Myc的m6A水平，促進表達，但c-Myc是原癌基因，與結果矛盾，值得深入分析。Hu等[22]發(fā)現(xiàn)miR-550-1可抑制WTAP表達，降低WWTR1 m6A的水平，抑制Hippo通路，阻礙AML的進展。胰腺癌中，研究表明WTAP可穩(wěn)定粘著斑激酶（focal adhesion kinase,Fak）mRNA，激活Fak/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）/Akt和 Fak/類固醇受體共激活劑 1（steroid receptor coactivator 1,Src1）/生長因子受體結合蛋白 2（growth factor receptor bound protein 2,GRB2）通路，增強癌細胞的遷移和侵襲能力。而Fak抑制劑GSK2256098可逆轉WTAP誘導的促癌作用[23]。Han等[24]發(fā)現(xiàn)piRNA-30473是彌漫大B細胞淋巴瘤的癌性因子，其高表達預示不良OS，通過上調WTAP，增加m6A水平，piRNA-30473可促進HK2的表達，導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展。lncRNA PCGEM1在肺癌中過表達，通過靶向miR-433-3p/WTAP可促進癌細胞增殖和遷移，過表達WTAP可部分逆轉敲低PCGEM1的抑癌作用[25]。WTAP高表達是肝癌患者預后不良的獨立危險因素。通過升高m6A，WTAP可抑制ETS1的表達，影響p21/p27的功能，發(fā)揮促癌作用[26]。Li等[27]發(fā)現(xiàn)高表達WTAP是胃癌患者預后不佳因素，其致癌作用和T細胞免疫反應相關基因的RNA高度甲基化相關。Tang等[28]發(fā)現(xiàn)在腎癌中WTAP高表達，且與更短的OS相關。體外敲低WTAP可促進ACHN和Caki-1細胞株的凋亡。機制研究表明WTAP可與CDK2的3'UTR結合，增強mRNA穩(wěn)定性，而CDK2抑制劑（SU9516和K03861）可逆轉WTAP的癌性功能。碳酸酐酶Ⅳ被認為是結腸癌中的抑癌因子，通過與WTAP結合可促進其泛素化降解，抑制Wnt通路的活性，阻礙腫瘤的進展[29]。因此，以上研究表明WTAP表達失調對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。

5 VIRMA在腫瘤中的作用

VIRMA又被稱為KIAA1429，在骨肉瘤中，研究發(fā)現(xiàn)其高表達，且與更短的OS相關[30]，而體外敲低KIAA1429后可抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。Lan等[31]在肝癌中發(fā)現(xiàn)KIAA1429高表達，且預示不良預后。沉默KIAA1429后可抑制癌細胞增殖和遷移能力，利用MeRIP-seq、RNA免疫共沉淀測序（RNA immunoprecipitation sequencing,RIP-seq）和 RNA-seq等方法，GATA3被證實為KIAA1429下游靶基因，通過增加m6A水平，引起RNA結合蛋白HuR分離，促進GATA3前體mRNA的降解。Qian等[32]發(fā)現(xiàn)BC中KIAA1429高表達，且與更短的OS相關。過表達KIAA1429可促進癌細胞的增殖和遷移。而RIP-seq方法確定其下游靶基因CDK1，KIAA1429通過非m6A修飾方法促進CDK1的表達，從而發(fā)揮促癌功能。在去勢抵抗的PCa中，Barros-Silva等[33]發(fā)現(xiàn)VIRMA是高表達的。敲除VIRMA后可降低m6A修飾的水平，繼而降低CCAT1和CCAT2的穩(wěn)定性，發(fā)揮抑癌功能?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)VIRMA在腫瘤中均起到致癌作用，但更多的研究需要被執(zhí)行，進一步明確其功能。

6 RBM15/15B在腫瘤中的作用

RBM15又稱為OTT或SPEN，而HUMAGCGB或OTT3是RBM15B的別稱。Patil等[34]報道RBM15/15B在lncRNA XIST介導X染色體上基因的轉錄沉默過程中具有重要作用。通常XIST至少有78個N-甲基腺苷殘基是呈高度甲基化狀態(tài)，由RBM15/15B介導實現(xiàn)，當敲低RBM15/15B，可逆轉XIST的甲基化狀態(tài)，影響其基因沉默功能。后續(xù)的研究表明RBM15/15B在實體瘤中表達異常，可參與疾病預后風險模型的構建，然而，分子機制還未闡明，有待進一步研究明確其功能。

7 ZC3H13在腫瘤中的作用

ZC3H13又被稱為KIAA0853或Xio。2018年Wen等[35]發(fā)現(xiàn)ZC3H13在細胞核內(nèi)可調控m6A修飾，在小鼠胚胎干細胞中，當敲低ZC3H13后，WTAP/Virilizer/Hakai所形成的RNA甲基化催化復合物失去了核內(nèi)定位功能，導致RNA甲基化失調，抑制干細胞自我更新，促進分化。而在果蠅體內(nèi)，Knuckles等[36]研究發(fā)現(xiàn)ZC3H13與WTAP相互作用對m6A甲基化調控具有關鍵作用，并對果蠅的性別決定具有重要意義。而在腸癌中，Zhu等[37]發(fā)現(xiàn)ZC3H13是一個抑癌基因，通過抑制Snail、Cyclin D1和增加Occludin的表達，可激活Ras-ERK通路并抑制癌細胞的增殖和侵襲力。目前有關ZC3H13的研究還較少，其具體功能和作用機制未完全闡明，亟待將來的研究可以明確ZC3H13在腫瘤中的作用。

8 m6A甲基轉移酶復合物調控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制

基于目前已發(fā)表的文獻，m6A甲基轉移酶復合物調控基因表達的機制具體為：（1）增加pri-miRNAs的m6A水平，招募DGCR8，促進其剪切成熟，抑制靶基因的表達；（2）增加靶基因m6A水平，與YTHDF2結合，促進靶基因的降解；（3）增加靶基因 m6A水平，與YTHDF1結合，促進靶基因的翻譯；（4）增加靶基因m6A水平，與IGF2BPs結合，增加靶基因的穩(wěn)定性；（5）招募或誘導分離mRNA結合蛋白，影響mRNA的穩(wěn)定性；（6）非依賴m6A方式結合靶基因的3'UTR，增強其穩(wěn)定性；（7）干擾m6A甲基轉移酶復合物的核內(nèi)定位信號，影響其甲基化功能。m6A甲基轉移酶復合物不同成員可通過上述機制調控下游癌性或抑癌性基因的表達，繼而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

9 小結與展望

近年來，隨著氣相-液相質譜、m6A測序、m6A單個核苷酸交聯(lián)免疫沉淀等技術的出現(xiàn)，科學家們發(fā)現(xiàn)m6A修飾廣泛存在于真核生物的RNA中并具有重要生物學功能，成為近十年來的研究熱點。盡管已發(fā)現(xiàn)了m6A修飾過程中“讀碼器”“消碼器”和“閱讀器”相關基因，但仍有許多機制未被闡明，新的調控基因陸續(xù)被報道。所以，目前有關m6A相關蛋白及其功能的研究尚處于探索階段。m6A甲基轉移酶在腫瘤中表達紊亂，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義，本綜述總結了已有研究中其對腫瘤的調控機制，但仍未完整。已有的研究發(fā)現(xiàn)部分m6A甲基轉移酶在不同腫瘤中與藥物治療及放射性治療敏感性、化學治療耐藥性密切相關，靶向m6A甲基轉移酶相應基因可增強腫瘤細胞的放、化療敏感性。雖然，目前只成功研發(fā)出了m6A去甲基化酶FTO的特異性小分子抑制劑，但m6A甲基轉移酶的靶向治療仍具有重大潛力。因此，在將來的研究中，進一步挖掘其作用機制對深入認識表觀遺傳學在惡性腫瘤中的功能、探索新的治療靶點具有重要意義，將為臨床精準治療提供重要指導作用。