內(nèi)生菌與藥用植物活性成分生產(chǎn)的研究進(jìn)展

劉朝波，錢 剛，李 林

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

我國藥用植物種類豐富，目前已發(fā)現(xiàn)的藥用植物約12 000余種，但多數(shù)藥用植物中的活性成分較低，且受到環(huán)境、遺傳等多種因素的影響。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，對于藥用植物的開發(fā)與利用進(jìn)入新的階段，如何穩(wěn)定或提高藥用成分生產(chǎn)和改變其傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式成為我國藥用植物生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)中的首要問題。內(nèi)生菌是藥用植物內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，一方面分泌植物激素、生長因子等，有利于植物生長發(fā)育；另一方面對藥用植物活性成分積累和生產(chǎn)具有調(diào)控作用，它們通過產(chǎn)生與宿主中活性成分相同或者相似的活性產(chǎn)物的方式增加宿主活性成分，或以植物原有的活性成分轉(zhuǎn)化為新的化合物從而增加活性成分種類[1]。值得注意的是，這些經(jīng)由內(nèi)生菌作用的化合物多數(shù)具有抗菌、抗腫瘤及抗氧化等作用，是當(dāng)前藥用成分研究與生產(chǎn)的熱點[2-4]。因此，對藥用植物內(nèi)生菌的研究也成為我國中藥材生產(chǎn)與新藥開發(fā)方面的重要內(nèi)容，本文就藥用植物內(nèi)生菌分離、分類概況及其在藥用成分開發(fā)應(yīng)用進(jìn)行闡述。

1 植物內(nèi)生菌的概念與分類

植物內(nèi)生菌(Endophyte)是一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，主要包括內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)、內(nèi)生細(xì)菌(Endophytic bacteria)、內(nèi)生放線菌(Endophytic actinomyces)[5]。從分布范圍和種類上看，內(nèi)生菌廣泛存在于藥用植物中，但種屬分布與其他植物有差異。如常見植物內(nèi)生真菌多為黃曲霉菌、擔(dān)子菌、接合菌、卵菌等，而藥用植物內(nèi)生真菌多為鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、頭孢菌屬(Cephalosporin)等，部分具有宿主的專屬寄生特異性[6-7]。目前已從藥用植物中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌超過80屬129種，多為假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(EnterobacterHormaecheandEdwards)、土壤桿菌屬(AgrobacteriumConn)、芽孢桿菌屬(BacillusCohn)。藥用植物中的內(nèi)生放線菌則主要為小雙孢菌屬(Microbispora)、小單孢菌屬(Micromonospora)和鏈孢囊菌屬(Streptosporangtum)，是當(dāng)前被廣泛用于挖掘新生物活性物質(zhì)的重要內(nèi)生菌種類。此外，不同于致病菌對宿主植物的破壞，內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌一方面以宿主藥用植物的代謝環(huán)境作為自身的外環(huán)境，吸收營養(yǎng)物質(zhì)的同時，又得到一定的保護(hù)；另一方面它們能合成小分子的物質(zhì)促進(jìn)宿主植物的生長和發(fā)育，在與其宿主植物經(jīng)過長期的能量物質(zhì)交換中逐漸形成了互惠共生的關(guān)系，對植物的生命活動也有積極作用[8]。

2 藥用植物內(nèi)生菌分離與鑒定

內(nèi)生菌的分離是藥用植物內(nèi)生菌研究中的首要步驟，其分離方法主要采用組織塊分離法與研磨法。組織塊分離方法是將植物的組織塊在適宜培養(yǎng)基上進(jìn)行菌絲培養(yǎng)的方法，通常包括以植物新鮮的根、莖、葉等組織器官作為外植體材料，經(jīng)過乙醇、次氯酸鈉或升汞等進(jìn)行消毒滅菌，并使用無菌水沖洗后轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)、NA培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)、高氏一號培養(yǎng)基等不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。對于內(nèi)生真菌一般采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、內(nèi)生細(xì)菌采用NA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、內(nèi)生放線菌采用高氏一號培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[9-11]。以分離金釵石斛(Dendrobiumnobile)內(nèi)生真菌為例，用自來水將金釵石斛的根、莖、葉沖洗干凈后晾干，然后進(jìn)行表面消毒，75 %酒精浸泡30 s，無菌水沖洗5次，隨后0.1 %升汞浸泡1 min，無菌水沖洗5次。接下來在無菌環(huán)境中將消毒后的葉剪成5 mm×5 mm的方塊，根、莖剪成0.5 cm長的片段，然后縱向剪成4個部分，并將切口緊貼于PDA培養(yǎng)基上，每皿放三片，5個重復(fù)，25 ℃ 環(huán)境培養(yǎng)，待菌絲長出后再進(jìn)行單菌落劃線等進(jìn)行純化，所得單菌株斜面保存。從甘草[12](Glycyrrhizauralensis)、艾蒿[13](Artemisiaargyi)、土木香[14](Inulahelenium)等藥用植物中采用組織塊法已成功分離出多種內(nèi)生菌。此外，對內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌的分離常采用研磨法，將消毒后的植物組織在無菌環(huán)境下切碎，放于無菌研缽中研磨至漿液，稀釋10倍，取50微升涂于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或者高氏1號培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)。

上述分離純化后的內(nèi)生菌通常采用形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定2種方法進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定是對菌株菌核的特征及結(jié)構(gòu)、孢子著生部位及其形態(tài)、大小、排列方式等對菌的種屬進(jìn)行初步鑒定。朱士茂[15]利用形態(tài)學(xué)方法鑒定從銀杏的根、莖、葉中分離得到的16株內(nèi)生菌，經(jīng)初步鑒定它們分別屬于產(chǎn)孢粘細(xì)菌屬(Pyxo-spore)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、革蘭氏陽性球菌屬(Gram-positivecocci)、芽孢菌屬(Bacilluscohn)、土壤桿菌屬(Agrobacteriumconn)。內(nèi)生細(xì)菌、放線菌通常采用分子生物學(xué)鑒定方法，一般通過16S rDNA測序進(jìn)行鑒定。首先對純化后菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA并進(jìn)行測序，將獲得序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對，即可獲知與該序列同源性較高的已知序列，為菌株的分類提供依據(jù)。宋穎娟[16]利用組織塊法從黃精(Polygonatumsibiricum)和黃芪(Astragaluspropinquus)的塊根中分離出17株菌株，通過16S rDNA測序分析，鑒別出黃精內(nèi)生菌有2株為腸桿菌屬(Enterobacterhormaecheandedwards)，4株為芽孢桿菌屬(Bacilluscohn)；黃芪內(nèi)生菌有8株為芽孢桿菌屬(Bacilluscohn)，2株為葡萄球菌屬(Staphylococcus)，1株為節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)。內(nèi)生真菌分子生物學(xué)鑒定一般采用ITS序列分析進(jìn)行種屬鑒定。Chen等[17]通過ITS rDNA 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定將鋸緣石杉莖、葉和根中分離到52株菌落形態(tài)不同的內(nèi)生真菌分為4類，其中92.31 %為梭狀芽孢桿菌屬。

盡管利用上述方法已實現(xiàn)對多種藥用植物中內(nèi)生菌的分離與鑒定工作，但近年來多個藥用植物內(nèi)生菌轉(zhuǎn)錄組測序工作的研究表明，通過上述方法得到的內(nèi)生菌種類較少，因此對于內(nèi)生菌分離方法還有待進(jìn)一步研究。

3 內(nèi)生菌參與藥用植物重要生命活動過程

已有研究認(rèn)為，各種環(huán)境因子(如溫度、光照、微生物等)與藥用植物適應(yīng)不同的生長環(huán)境，以及多樣化的活性成分的合成相關(guān)[18-19]。內(nèi)生菌作為其中重要的環(huán)境因子，對于藥用植物的重要生命活動過程均具有密切的關(guān)系。如蘭科植物的天麻、白及等種子需要在內(nèi)生菌作用下萌發(fā)與生長[20-21]。對石斛、甘蔗及芒萁等的研究表明內(nèi)生菌不僅有利于植物根系生長，加速對氮、磷、鉀元素的吸收，也產(chǎn)生細(xì)胞激動素、生長激素(吲哚乙酸、赤霉素)等，促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)植物抗逆能力[22-26]。此外，藥用植物內(nèi)生菌以多種方式參與到其次生代謝產(chǎn)物合成與代謝途徑中。

3.1 內(nèi)生菌促進(jìn)藥用植物的生長發(fā)育 內(nèi)生菌對藥用植物的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用，并以不同方式促進(jìn)藥用植物的生長。高濃度乙烯會抑制植物生長，有些內(nèi)生菌因具有ACC(氨基環(huán)丙烷羧酸)脫氨酶活性，可以分解乙烯的前體，降低藥用植物體內(nèi)乙烯的含量，從而促進(jìn)植物的生長[27]。張緹等[28]從絞股藍(lán)(Gynostemmapentaphyllum)中篩選出6株具有ACC脫氨酶活性的細(xì)菌，其中1株被驗證為木糖葡萄球菌的菌株具有顯著的促生作用。鐵對植物的生長發(fā)育具有很重要的作用，植物缺鐵會降低植物的抗性、出現(xiàn)黃葉病[29]。而促生菌分泌的鐵載體可以和土壤中Fe3+結(jié)合將其還原成Fe2+，使土壤中可溶鐵的含量增加，提高植物對土壤中鐵的利用率，促進(jìn)藥用植物的生長[30]。宋歡等[31]從雷公藤(Tripterygiumwilfordii)中分離得到NS3與LY1、NS33與LG3混合培養(yǎng)均可提高鐵載體的含量，提高雷公藤對鐵的利用率，促進(jìn)其生長。藥用植物對氮、磷、鉀等元素的吸收能力會影響其的生長能力。張曉冰等[32]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌具有固氮、磷酸鹽溶解、鉀溶解等作用，可以促進(jìn)植物對氮、磷、鉀等元素的吸收。另外，植物激素也是促進(jìn)植物生長的重要因素，很多內(nèi)生菌可以產(chǎn)生植物激素，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長。黃柳彬等[33]從田七中分離出9株內(nèi)生細(xì)菌，其中有7株能產(chǎn)生IAA(吲哚-3-乙酸)，具有促進(jìn)宿主生長作用。綜上，內(nèi)生菌可通過生物固氮、產(chǎn)生鐵載體、溶磷或分泌產(chǎn)生植物生長素等方式促進(jìn)藥用植物的生長發(fā)育。

3.2 內(nèi)生菌參與藥用植物抗逆過程 前人研究表明，內(nèi)生菌能有效的提高藥用植物對病原菌的抵抗作用。陳利云等[34]用銀杏葉片內(nèi)生菌乙醇提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ浸泡處理鳳尾雞冠花種子及葉面噴施溫室盆栽試驗，實驗結(jié)果表明，內(nèi)生菌醇提取物Ⅵ提高植物對病原真菌感染的抵抗力。內(nèi)生菌能有效的促進(jìn)藥用植物抗旱性提高。張霞[35]通過接種內(nèi)生菌，研究了內(nèi)生菌對鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)抗逆性的影響，發(fā)現(xiàn)接種GDB162和GS222的鐵皮石斛苗表現(xiàn)出較高的抗旱性。內(nèi)生菌與植物共培養(yǎng)能提高植物在高溫環(huán)境下的生存能力。Redman等[36]發(fā)現(xiàn)牛膝草(Hyssopusofficinalis)與彎孢菌共培養(yǎng)后可連續(xù)十天在65 ℃ 環(huán)境下生存，沒有與彎孢菌共培養(yǎng)的牛膝草在50 ℃時則出現(xiàn)干癟現(xiàn)象。重金屬對植物具有毒性作用，把植物與內(nèi)生菌共培養(yǎng)可以使植物的抗金屬能力增強(qiáng)。Govarthanan等[37]從耐鹽植物中分離出45株內(nèi)生菌用于抗金屬實驗，結(jié)果表明大多數(shù)菌株具有抗金屬能力。因此，具有抗旱、抗高溫等抵抗作用的內(nèi)生菌應(yīng)用在藥用植物培養(yǎng)中，可提高藥用植物抗逆、耐害，增強(qiáng)其對環(huán)境適應(yīng)能力。

3.3 內(nèi)生菌促進(jìn)藥用植物中次生代謝產(chǎn)物合成 內(nèi)生菌可以利用其代謝產(chǎn)物和藥用植物中某些成分以及植物體內(nèi)的有效成分為前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為新的化合物，經(jīng)內(nèi)生菌代謝產(chǎn)生新的活性成分[38]。彭清忠等[39]分離得到能轉(zhuǎn)化姜黃素的內(nèi)生真菌Diaporthesp.，其能把姜黃素轉(zhuǎn)化為去甲基姜黃素和二去甲基姜黃素。隆麗林等[40]采用薄層層析法篩選轉(zhuǎn)化虎杖苷的內(nèi)生真菌，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)其中l(wèi)株內(nèi)生真菌能轉(zhuǎn)化虎杖苷形成新的化合物。然而某些內(nèi)生菌并不是直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具有藥用成分，而是促進(jìn)植物次級代謝產(chǎn)物的積累，從而影響植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，對藥用植物活性產(chǎn)物的產(chǎn)量有著積極的影響。李艷冰等[41]從滇重樓地下塊莖中分離得到23株內(nèi)生菌，將它們與滇重樓組培苗進(jìn)行共生培養(yǎng)后，經(jīng)高效液相色譜法檢測組培苗的皂苷含量，篩選出兩株能促進(jìn)滇重樓組培苗皂苷含量的菌株。

內(nèi)生菌對藥用植物次生代謝途徑具有調(diào)控作用，內(nèi)生菌在藥用植物次生代謝途徑中可被作為誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)宿主植物細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物的合成，提高藥用植物的產(chǎn)量及活性成分的含量。戴傳超等[42]將從大戟分離得到的鐮刀菌的菌絲提取液加入培養(yǎng)了21天的大戟懸浮細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)大戟細(xì)胞的產(chǎn)量比對照組高34.13 %。陳曉梅等[43]研究中發(fā)現(xiàn)在離體培養(yǎng)的條件下，內(nèi)生真菌和金釵石斛共同培養(yǎng)能夠提高多糖的含量，并能影響生物堿的含量。王劍文等[44]發(fā)現(xiàn)黃花蒿內(nèi)生菌細(xì)胞壁寡聚糖提取物可以誘導(dǎo)黃花蒿生根細(xì)胞中鈣離子的增加，從而提高青蒿素的產(chǎn)量。張瑞芬等[45]用內(nèi)生菌尖孢鐮刀菌Dzf17滅活的菌絲和菌液濃縮物誘導(dǎo)盾葉薯蕷無菌苗和培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)采用滅活菌絲誘導(dǎo)后皂苷元產(chǎn)量比對照組提高了2.87倍和2.01倍；采用菌液濃縮物誘導(dǎo)盾葉薯蕷無菌苗和培養(yǎng)細(xì)胞后皂苷元產(chǎn)量比對照組提高了1.52倍和1.76倍。柳倩等[46]從香茅草中分離得到芽孢桿菌屬的內(nèi)生菌CcLf-2，再將CcLf-2接種到香茅草無菌苗中，通過實時定量PCR分析表明，CcLf-2的存在可誘導(dǎo)香茅草中檸檬醛生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上升。因此，內(nèi)生菌對藥用植物中次生代謝產(chǎn)物合成具有一定積極作用，使用合適的內(nèi)生菌作用在藥用植物上可以提高其次生代謝產(chǎn)物含量，為提高藥用植物工業(yè)化生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提供新思路。

4 內(nèi)生菌生產(chǎn)藥用活性成分的應(yīng)用

近年來，眾多研究表明藥用植物內(nèi)生菌不僅可以調(diào)控植物的次生代謝通路實現(xiàn)對藥用活性成分生產(chǎn)的調(diào)節(jié)，其自身也生產(chǎn)具有藥物活性的多種代謝產(chǎn)物，且這些代謝產(chǎn)物大多具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化作用[47-48]。因此，內(nèi)生菌也成為當(dāng)前藥物生產(chǎn)的新領(lǐng)域。

隨著人類體內(nèi)病原菌的抗藥性的不斷增強(qiáng)，人們急需找到更多、更好抗菌活性的藥物。前人研究表明，內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物具有良好抗菌活性[49-50]。陳淑娟等[51]從紅豆杉的樹皮中分離得到一株產(chǎn)紫杉醇類化合物的內(nèi)生真菌，使用不同溶劑對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取，并將提取物分別作用在大腸桿菌、白色鏈珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌上，提取得到的次生代謝產(chǎn)物對上述5種致病菌都具有不同程度的抑制作用。遲惠榮等[52]從多花黃精中分離的內(nèi)生菌中篩選出一株貝萊斯芽胞桿菌，該菌發(fā)酵液提的粗取物脂肽會抑制尖孢鐮刀菌的生長，抑制率達(dá)到51.6 %。

藥用植物中部分內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤活性，常見的有喜樹堿、長春堿、紫杉醇等。目前，已有研究證實從短葉紫杉、云南紅豆杉、銀杏等眾多藥用植物中可以分離得到能產(chǎn)生紫杉醇及其衍生物的內(nèi)生真菌[53]。長春新堿是治療白血病和淋巴瘤等癥的重要抗癌藥物之一，它們通過與未形成紡錘體的微管蛋白結(jié)合，導(dǎo)致紡錘體的合成受阻，從而間接達(dá)到抗腫瘤的作用[54-55]。張玲琪等[56]從長春花莖的韌皮部分離出一種內(nèi)生真菌為尖孢鐮刀菌，并通過菌株培養(yǎng)與分析，證明了該菌株能產(chǎn)生抗腫瘤藥長春新堿成分。喜樹堿是從我國特有植物喜樹的種子和根皮中提取的一類生物堿，該堿可以抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，導(dǎo)致DNA斷裂，從而使腫瘤細(xì)胞死亡[57]。劉吉華等[58]在喜樹的根、枝條、葉、果實中分離得到48株內(nèi)生真菌，經(jīng)實驗證明其中多數(shù)能產(chǎn)生喜樹堿類似物，都具有不同程度的抗腫瘤效果。除了紫杉醇、長春新堿、喜樹堿具有抗腫瘤活性以外，細(xì)胞松弛素類、石蒜堿、秋水仙素堿類等內(nèi)生真菌次代謝產(chǎn)物也具有抗腫瘤活性。

抗氧化活性一直是全球研究的熱點，抗氧化物質(zhì)具有預(yù)防衰老等多種藥理作用[59]。目前從藥用植物內(nèi)生菌中分離的多種次生代謝產(chǎn)物被證實具有抗氧化活性，受到廣泛關(guān)注。金衛(wèi)華等[60]從櫻桃皮分離得到7株內(nèi)生菌，對它們的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了抗氧化活性測試，結(jié)果表明有6株霉菌菌株均具有抗氧化活性。張新國等[61]從藥用植物烏頭、唐松草、獨活、車前草、薄荷、澤瀉中分離得到61株內(nèi)生菌，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)內(nèi)生菌次生代謝物具有抗氧化活性。

綜上表明，藥用植物中內(nèi)生菌的多種代謝產(chǎn)物具有其宿主植物的藥用活性成分的藥理作用或具有不同于宿主的其他藥理活性，對于瀕危藥用植物的保護(hù)、新藥物合成與開發(fā)具有重要的意義。

5 展望

多數(shù)藥用植物內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物具有藥用活性，其在新藥開發(fā)中具有巨大的開發(fā)潛力。如果未來能利用藥用植物內(nèi)生菌生產(chǎn)藥物，這將在一定程度上彌補(bǔ)了自然資源的短缺，間接保護(hù)部分瀕危藥用植物，對藥用植物內(nèi)生菌的開發(fā)與利用具有現(xiàn)實的理論價值與應(yīng)用意義。然而，要實現(xiàn)對藥用植物內(nèi)生菌的應(yīng)用仍存在需要解決的關(guān)鍵問題：1)并不是藥用植物中的內(nèi)生菌都能在人工培養(yǎng)基上面生長。2)使用常規(guī)的微生物發(fā)酵法和組織培養(yǎng)法培養(yǎng)的植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物含量低，目前不能夠大量地生產(chǎn)。3)篩選效率普遍不高，部分藥用植物內(nèi)生菌未被發(fā)現(xiàn)，部分藥用植物內(nèi)生菌的活性代謝產(chǎn)物未被挖掘。隨著相關(guān)生物技術(shù)不斷發(fā)展、植物內(nèi)生菌的人工培養(yǎng)基種類增加以及組分不斷優(yōu)化，藥用植物內(nèi)生菌分離效率及其在藥用活性成分開發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用將得到更好發(fā)展。