Wnt信號通路在肺間質(zhì)纖維化中的研究進展

縱加強，韓志海

間質(zhì)性肺疾?。╥nterstitial lung diseases，ILDs）是一組以肺間質(zhì)及肺泡腔損害為主的疾病，組織學上表現(xiàn)為肺泡壁被各種炎癥細胞、纖維蛋白和正常肺泡壁增殖的細胞所浸潤。ILDs 肺纖維化過程中涉及多條信號通路，其中Wnt信號通路廣泛參與肺纖維化過程，機體正常的生理過程中能夠促進肺的生長和發(fā)育，而在損傷修復過程中可被過度激活導致肺纖維化，其中特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pul‐monary fibrosis ,IPF）的研究最為成熟，如特征性的胸膜下纖維化可能與Wnt5a的受體或共受體ROR2有關、β-catenin 的核積聚是肺纖維化共同的特征、經(jīng)典的Wnt 信號通路在細胞及動物纖維化模型中普遍被檢測到了異常激活；繼發(fā)性肺纖維化如新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）、結締組織?。╟onnective tissue dis‐eases，CTD）及煙霧相關肺纖維化也發(fā)現(xiàn)Wnt 信號通路過度激活。另外基于Wnt 信號通路的治療也有了一定的進展。

1 Wnt信號通路

Wnt 信號通路可分為經(jīng)典Wnt 信號通路（即Wnt/β-catenin 信號通路）和非經(jīng)典Wnt 信號通路。其中，β-catenin 是介導經(jīng)典Wnt 信號的關鍵分子，在胞內(nèi)由APC、Axin 及GSK-3β 等組成的β-catenin降解復合體控制，轉入核內(nèi)可促進靶基因的轉錄[1]；非經(jīng)典Wnt 信號通路主要包括Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路[2]。

經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt 信號通路的區(qū)別不僅在于是否依賴β-catenin分子，非經(jīng)典Wnt信號通路還需要不同的G蛋白進行信號轉導[3]；兩者相互影響，非經(jīng)典Wnt 信號通路不僅可以通過影響GSK 的磷酸化調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號，還可以與Hippo-YAP/TAZ 信號通路相互作用，增加經(jīng)典Wnt信號通路傳導抑制劑的分泌，如Dickkopf-1（Dkk-1），Wnt5a/b 等。此外，Wnt-FZD 信號傳導的過程很大程度上取決于細胞內(nèi)環(huán)境中不同Wnt 配體的相對密度，LRP5/6 及Dvl 的選擇作用也決定信號傳導方向[4]。因此兩者整體效應在通路水平上可能最終取決于多種配體-受體連接和不同途徑的綜合影響。

病理條件下Wnt信號通路失調(diào)，當修復過程轉變?yōu)槁詴r可導致纖維化發(fā)生，表現(xiàn)為持續(xù)損傷修復、機體細胞重新編譯、細胞外基質(zhì)異常沉積，最終導致功能障礙。 目前研究提示異常的Wnt/β -catenin 信號傳導可能是心臟、肝臟、皮膚、肺等纖維化中關鍵的信號傳導途徑，有可能成為纖維化疾病治療的新靶點。

2 Wnt信號通路與特發(fā)性肺纖維化

IPF 的組織學特征是進行性肺部瘢痕形成和出現(xiàn)普通間質(zhì)性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP），如上皮下成纖維細胞灶、胸膜下肺纖維化和網(wǎng)格樣改變，目前認為肺成纖維細胞的過度增殖是纖維化發(fā)生的最直接原因，動物實驗發(fā)現(xiàn)纖維灶中約33%的成纖維細胞來自上皮細胞間質(zhì)轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT） ，約20%來自骨髓干細胞[5]，間充質(zhì)干細胞及其他來源約占剩余50%。

EMT 是肺纖維化關鍵一環(huán)，支氣管-肺泡連接處和胸膜下上皮異常增殖分化為成纖維細胞，這種特殊區(qū)域的改變可以解釋IPF/UIP典型的胸膜下網(wǎng)格樣改變。Liu等人[6]的研究結果也表明小鼠胸膜間皮細胞與胸膜下區(qū)域的肺成纖維細胞可互相干擾，促進間皮-間質(zhì)轉化及成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，同時激活Wnt/β-catenin、TGF-β1 和CD147 信號通路，促進肺纖維化。有研究還發(fā)現(xiàn)在氣道損傷誘導的II型肺泡上皮細胞中，經(jīng)典Wnt信號被激活，進而促進間質(zhì)成纖維細胞的增殖和肺組織重塑，短暫性重塑可消退，而持續(xù)性重塑會導致肺纖維化[7]；其次在肺內(nèi)皮細胞中經(jīng)典的Wnt/β-catenin 信號會使血管周圍成纖維細胞向肌成纖維細胞樣轉變，導致細胞外基質(zhì)（extracellular matrix ，ECM）積累和組織硬度增加，進一步促進肺纖維化[8]。

經(jīng)典Wnt 信號也參與間充質(zhì)干細胞向成纖維細胞的分化。TGF-β1可使肺駐留的間充質(zhì)干細胞驅動分化為肌成纖維細胞，伴隨p-GSK-3β 明顯上調(diào)，β-catenin 持續(xù)累積，加快基因轉錄，增加ECM的沉積，而ICG-001（β-連環(huán)蛋白/CBP 特異抑制劑）可阻斷上述改變[5]。另外一些成熟細胞也可以提供干細胞功能，在特定的微環(huán)境下，Wnt 信號通路控制細胞的增殖和分化。如肺泡成纖維細胞可分泌Wnt5a 及少量一種或兩種其他Wnt，包括Wnt2、Wnt2b、Wnt4 和Wnt9a，少數(shù)位于單個成纖維細胞附近的Wnt靶標Axin2（+）肺泡II型細胞可維持其干細胞活性，脫離該微環(huán)境便分化為肺泡I 型細胞[9]；同樣Axin2（+）肌成纖維祖細胞在損傷后優(yōu)先產(chǎn)生肌成纖維細胞[10]，分泌大量ECM，促進肺纖維化。

上述研究均證實了Wnt信號通路在IPF中的致纖維化作用。治療上盡管進行了許多臨床前的研究，如上述ICG-001、Linderapyrone（抑制TCF/β -catenin 活性）、Wnt-C59（減少β-連環(huán)蛋白和NF-κB的相互作用）等，但臨床中目前IPF并無Wnt相關的特效治療藥物，上述發(fā)現(xiàn)既有助于解釋IPF 發(fā)病的機制，也可為進一步尋找新的治療靶點提供參考。

3 Wnt信號通路與繼發(fā)性肺間質(zhì)纖維化

3.1 Wnt信號通路和COVⅠD-19 相關肺纖維化 研究發(fā)現(xiàn)去年開始流行的COVID-19患者在急性期間部分胸部CT 已經(jīng)顯示出肺纖維化改變[11]，隨后我國學者進行的世界首例COVID-19大體解剖及后續(xù)學者進行的肺穿刺病理也均提示不同程度的肺纖維化改變[12]。

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome ，ARDS）是繼發(fā)性肺纖維化最重要的危險因素之一，有研究數(shù)據(jù)顯示約14.8%[13]COVID-19 患者最終發(fā)展為ARDS。多項關于COVID-19 的研究發(fā)現(xiàn)參與肺纖維化的細胞因子TGF-β、IL-6、TNF-α等增加[14]，進一步研究表明TGF-β 和經(jīng)典Wnt 信號通路以正反饋方式相互上調(diào)，在COVID-19患者中，TGF-β 刺激經(jīng)典Wnt 信號通路過度激活，導致肺纖維化和肺部感染的風險增加[15]。

在膿毒癥或ARDS 中，Wnt5a 信號激活在肺部炎癥和纖維化中起關鍵作用，Wnt5a 是成纖維細胞增殖的重要調(diào)節(jié)劑，具有抗凋亡的作用，可促進ECM 沉積[16]；Wnt11 蛋白可通過調(diào)節(jié)NF-κB 活性，抑制炎癥性細胞因子的誘導[17]，Wnt5a 和Wnt11 對炎癥反應具有彼此相反的功能。為了研究Wnt5a和Wnt11與COVID-19的相關性，Eun等人[18]收集了SARS-CoV-2 檢測陰性的正常人、SARS-CoV-2 患者、SARS-CoV-2 ARDS 患者以及感染SARS-CoV-2住院后出院患者的血液，發(fā)現(xiàn)Wnt5a 可促進炎癥，是預示SARS-CoV-2 ARDS 患者預后不良的指標；Wnt11 可有效抑制炎癥反應和細胞因子的產(chǎn)生，可能是疾病生存能力良好的指標。

最新研究表明COVID-19血清中TGF-β的顯著增加，使Wnt5a 表達上調(diào)[19]。因此，單純中和Wnt5a效果可能不佳，需進一步研究Wnt與TGF-β 信號通路在COVID-19 患者中關系，在通路水平上尋找可能早期抑制纖維化發(fā)展的治療措施。

3.2 Wnt 信號通路在結締組織病相關肺纖維化中的作用 肺是CTD 常見的侵襲器官, ILDs 已成為CTD患者發(fā)病和死亡的主要原因[20]。

研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）最常與ILDs 相關。Christian 等人[21]發(fā)現(xiàn)在SSc患者皮膚中，成纖維細胞β-catenin的核水平顯著增加，并且與Wnt1 和Wnt10b 的表達增加有關；βcatenin 的特異性缺失則抑制博來霉素誘導的皮膚纖維化。 Anna 等人[22]也發(fā)現(xiàn)SSc 相關的晚期肺纖維化患者中肺成纖維細胞灶、纖維母細胞、氣道和肺泡上皮細胞中核β-catenin蓄積，促進肺成纖維細胞的遷移和增殖。上述可見β-catenin 是SSc 中成纖維細胞活化和組織纖維化的關鍵因素，經(jīng)典Wnt信號通路參與SSc相關肺纖維化。

為證實Wnt作用，使用重組sFRP4（Wnt通路拮抗劑）可降低β-catenin 和α-SMA 表達的水平以及肌成纖維細胞的數(shù)量。最近的研究也發(fā)現(xiàn)SSc 真皮成纖維細胞中，microRNA27a-3p 水平顯著升高，從表觀遺傳上降低了sFRP1 水平，導致Wnt 信號傳導增強[23]。這表明同其他組織纖維化一樣，藥物或通路抑制劑可通過干擾Wnt 信號抑制成纖維細胞增殖、分化和EMT來控制肺纖維化。

3.3 Wnt 信號通路和煙霧吸入致肺間質(zhì)纖維化目前研究表明香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）可以顯著增加人胚肺成纖維細胞α-SMA的表達，表明CSE可以促進肺成纖維細胞向成肌纖維細胞的分化[24]。火災時煙霧吸入性急性肺損傷（smoke induced acute lung injury，SI-ALI）涉及炎癥反應、氧化應激等，后期也發(fā)現(xiàn)了纖維化改變。Feng 等人[25]使用自制的煙霧發(fā)生器發(fā)現(xiàn)大鼠煙霧吸入后第28 天肺組織出現(xiàn)明顯的膠原蛋白沉積；LC等人[26]在大鼠上證明了隨著時間的延長，煙霧吸入后的肺組織中馬松染色及天狼星紅染色顯示膠原沉積逐漸增加。因此，作者推斷CSE及SI-ALI導致的纖維化與IPF 的發(fā)生可能有相同的機制，都涉及Wnt信號通路的過度激活。

為了驗證上述觀點，Marco將A549細胞暴露于CSE后，Wnt受體過度表達，經(jīng)典Wnt信號通路被激活，EMT相關的基因及蛋白表達失調(diào)，如波形蛋白、MMP-2、MMP-7、TGF-β1，趨化因子CCL-2表達顯著增高，A549 細胞也逐漸變成細長形狀的成纖維細胞且具有更高的遷移能力[27]。這表明從細胞層面上CSE 通過Wnt信號通路參與EMT，誘導各種促纖維化基因的表達，并促進成纖維細胞的遷移，加速肺纖維化的發(fā)生。Yumei 也發(fā)現(xiàn)人皮膚瘢痕組織的成纖維細胞（keloid fibroblasts, KFB）中β-catenin表達明顯增加，敲除β-catenin 或Wnt2 基因都會抑制經(jīng)典Wnt 信號通路和細胞周期蛋白cyclin D1 表達，KFB 細胞的生長明顯變慢，細胞倍增時間顯著延長，并抑制纖維化表型[28]。上述研究說明無論在肝臟、腎臟、皮膚，都有證據(jù)表明Wnt信號通路的激活促進纖維化是一個普遍的現(xiàn)象，為火災煙霧相關的研究奠定基礎。

目前為止，火災煙霧吸入性肺纖維化相關報道較少提及，與Wnt 信號通路相關的文獻很少，考慮CSE 與火災煙霧成分的差別，肺部微環(huán)境與皮膚、腎臟等的差異，需要進一步通過細胞及動物實驗探索Wnt/β-catenin 信號通路與煙霧吸入性肺纖維的關系，為尋找相關治療提供可能。

3.4 經(jīng)典Wnt 信號通路參與百草枯中毒引起的肺纖維化 研究發(fā)現(xiàn)百草枯纖維化肺組織中Wnt/βcatenin 信號分子，如MMP - 2、β - catenin、Wnt3a、Wnt10b、Cyclin D1 和WISP1 等表達水平顯著升高，肺上皮細胞和成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，而這一作用在體內(nèi)外均可被Wnt 信號通路的拮抗劑Dkk-1抑制。更加說明了Wnt信號通路參與肺纖維化的普遍性。

4 Wnt信號通路相關治療

4.1 Dkk-1 Dkk-1 是天然的Wnt信號通路拮抗劑，通過結合LRP5/6、Kremen-1/2拮抗β-catenin信號傳導，已被證實在細胞實驗及動物實驗可以抑制纖維化相關分子的表達，如α-SMA、膠原蛋白，減輕肺纖維化及肝臟纖維化[6]。

Alfiya 發(fā)現(xiàn)Dkk-1 過表達可改善由I 型TGF-β受體信號誘導的皮膚纖維化，并在其他TGF-β依賴性動物模型中預防了纖維化。Dkk-1的過度表達在Tsk-1 小鼠的炎癥模型以及炎癥非依賴性模型（如纖維化）中阻止了纖維化。Dkk-1 表達水平降低可導致人纖維化中經(jīng)典Wnt 途徑的激活，目前Dkk-1被研究作為其他疾病的潛在治療靶點（如肝纖維化），與靶向單個Wnt 蛋白相比，Dkk-1 可以更廣泛地抑制經(jīng)典Wnt 信號通路。因此，Dkk-1 及其類似物可能是通過Wnt信號途徑抗纖維化的有效手段。

4.2 sFRPs sFRPs 也是一種天然的拮抗Wnt 的分泌蛋白，可抑制Wnt 與Wnt 受體之間的相互作用，從而阻斷Wnt 信號的傳導。在肛門括約肌損傷相關的纖維化的兔模型中，切開肛門外括約?。╡x‐ternal anal sphincter, EAS）后纖維組織替代，免疫組化發(fā)現(xiàn)β-catenin 活化，纖維化標志物水平增加了1.5～2 倍，局部注射sFRP-2 可減弱β 連環(huán)蛋白的活化和纖維化，EAS 肌肉含量和功能得到顯著改善[29]；sFRP-1 基因敲除的小鼠隨著年齡的增長也出現(xiàn)了明顯的心臟纖維化及心功能惡化[30]。因此sFRPs 的異常分泌會導致纖維化的發(fā)生，抑制sFRPs可能會有效抑制纖維化。

4.3 阻斷Wnt信號傳導的藥物 從阻斷Wnt信號傳導的角度，有學者認為最有效的靶標是TCF 與βcatenin 的復合物，因其是信號傳導的關鍵連接點，并在通路下游起關鍵作用。盡管有學者提出幾種該復合物的抑制劑，如PKF115-854 和CGP049090，但由于其表面不易被抑制劑取代，因此還需進一步研究。研究顯示，Wnt途徑中最特異性的小分子抑制劑可能是IWP-2，可高度選擇性滅活Porc，從而阻斷Wnt 蛋白酰化2，但目前該藥物的應用僅限于細胞培養(yǎng)實驗。

5 總結

大量的證據(jù)支持Wnt 信號通路是器官纖維化的重要原因，無論是IPF 還是繼發(fā)性的纖維化改變，Wnt信號的激活可能是不同的肺纖維化疾病的共同特征，同一種疾病也可同時涉及經(jīng)典及非經(jīng)典的Wnt 信號通路。動物實驗中Wnt 信號抑制劑干預纖維化是進一步開發(fā)減弱或消除器官纖維化的藥物的重要基礎。因此，進一步探索Wnt信號通路與其他致纖維化通路間相互的關系至關重要，如TGF-β 與Wnt 信號通路，未來需要更多的臨床前及臨床研究來加以論證。