川崎病小鼠模型研究進展

蔡小紅 盧燕波 吳軍華 邱海燕

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種小兒常見病，其發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)取代風濕熱成為北美、歐洲、日本等發(fā)達國家或地區(qū)兒童后天獲得性心臟病的主要原因[1]。然而，該病的病因和發(fā)病機制尚不明確，目前臨床上尚無特異性試驗和生物標志物可用于診斷KD，臨床組織樣本取材困難也進一步限制了人們對KD的深入研究。因此，構建出符合KD臨床特征的小鼠模型顯得極為重要，現(xiàn)就近年來關于構建KD小鼠模型的國內外研究新進展作一綜述。

1 KD概述

KD又稱為黏膜皮膚淋巴結綜合征，是一種以全身性血管炎為病理變化的急性自限性、發(fā)熱性疾病，好發(fā)于5歲以下嬰幼兒[2]。其臨床典型特征包括持續(xù)5 d以上的高熱且抗生素治療無效、非化膿性頸部淋巴結腫大、眼結合膜充血、唇充血皸裂、草莓舌、手足硬性水腫、皮疹（包括原卡介苗接種部位紅斑）等[3]。KD可損害患兒的心臟和冠狀動脈，表現(xiàn)為冠狀動脈擴張、冠狀動脈瘤，甚至可導致缺血性心臟病和猝死的發(fā)生[2]。研究表明，未經(jīng)治療的KD患兒發(fā)展為冠狀動脈瘤的風險可高達25%，在及時接受高劑量靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）治療患兒中，這一比例可下降至4%左右，但仍有10%～20%的患兒對IVIG治療無反應，導致冠狀動脈瘤的加速發(fā)展[2]。有研究認為KD患兒的心血管后遺癥可延續(xù)到成年[4]。

流行病學資料提示，鏈球菌、腺病毒、反轉錄病毒等多種病原體感染可能為KD的病因，但均未得到證實。有研究認為，川崎病是由免疫介導的，遺傳易感因素與多種感染因子相互作用的結果[5]。

2 KD小鼠模型

近年來，許多學者采用小鼠、幼豬、幼兔和犬等動物成功構建了KD動物模型，由于小鼠品系較多，取材較為方便，誘導方式較豐富，成本也比其他實驗動物更低，所以目前國內外研究大多選用小鼠來構建KD動物模型。

2.1 干酪乳桿菌細胞壁成分（lactobacillus casei cell wall extract，LCWE）誘導的KD模型 干酪乳桿菌是一種革蘭陽性菌，在人和動物的胃腸道和泌尿生殖道中均有定植[6]。LCWE主要由肽聚糖組成，含有豐富的鼠李糖，可以對抗溶菌酶的降解[7]。1985年，Lehman等[7]將制備的LCWE單次腹腔注射于不同的近交系小鼠體內，發(fā)現(xiàn)LCWE可誘導小鼠產(chǎn)生局灶性冠狀動脈炎，且冠狀動脈損傷在組織學上與臨床KD患兒相似。

LCWE誘導的小鼠模型在組織學上與人類KD有許多相似之處，主要包括以下幾個方面。

LCWE誘導的KD模型與人類KD在血管損傷病理過程中的相似之處。臨床尸檢研究顯示，KD血管損傷包括連續(xù)相關的3個病理過程：急性自限性壞死性動脈炎、亞急性/慢性血管炎和腔內肌成纖維細胞增殖（luminal myofibroblast proliferation，LMP）[8]。Noval等[9]通過研究表明，LCWE誘導模型特征是主動脈根部炎性細胞浸潤和細胞外基質的破壞、冠狀動脈中壞死性動脈炎的發(fā)展、LMP引起冠狀動脈部分或完全阻塞，可基本概括上述人類KD的3個病理過程。LCWE誘導模型也可模擬KD冠狀動脈狹窄，其特征是冠狀動脈狹窄、嚴重的冠狀動脈炎和彈性蛋白降解，且LMP在冠狀動脈狹窄的形成過程中至關重要[10]，這與伴有冠狀動脈瘤的KD患兒的組織學特征相似[8,11]。

KD是一種巨噬細胞相關的血管性疾病，促炎性M1型巨噬細胞可在急性KD的血管損傷中發(fā)揮重要作用[12-13]。研究表明，LCWE誘導的巨噬細胞炎癥反應也參與了KD小鼠模型的血管損傷[14-15]，而巨噬細胞功能缺陷的C3H/HeJ小鼠在注射LCWE后不能誘導冠狀動脈炎的發(fā)生[7]。

LCWE誘導的KD模型與人類KD在心肌損傷過程中的相似之處。KD患兒冠狀動脈血栓閉塞可導致缺血性心臟病的發(fā)生[11]，在LCWE誘導小鼠的冠狀動脈中也可觀察到類似的組織血栓閉塞[5]。KD患兒的心肌炎可致心肌功能障礙和纖維化，并可導致其長期心血管后遺癥。LCWE誘導模型不僅可觀察到小鼠急性心肌炎的發(fā)生，在誘導KD血管炎后于恢復期給予腎上腺素能刺激也可誘發(fā)小鼠的心肌纖維化和心肌功能障礙[16]。與臨床KD相似，LCWE誘導小鼠也表現(xiàn)出電生理、心電圖異常和心臟神經(jīng)重塑，并可通過IL-1受體拮抗劑阿那白滯素（Anakinra）得到有效預防或改善[17-18]。

基于KD臨床特征，許多學者發(fā)現(xiàn)T細胞、IL-1、TNF和1,4,5-三磷酸肌醇3激酶C（inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase C，ITPKC）等在LCWE誘導模型致病過程中發(fā)揮重要作用，具體如下：

LCWE誘導模型依賴于T細胞，CD4+T細胞和CD8+T細胞都存在于LCWE誘導的冠狀動脈病變中，CD8+T細胞耗竭治療可防止LCWE誘導小鼠的血管炎進展，RNA測序也發(fā)現(xiàn)了與CD8+T細胞細胞毒性功能相關的基因表達增加，而CD4+T細胞缺乏并不影響LCWE誘導KD血管炎的發(fā)生、發(fā)展[9]。Schulte等[19]分別向RAG1-/-小鼠、B cellnull小鼠和野生型小鼠單次腹腔注射LCWE，發(fā)現(xiàn)所有RAG1-/-小鼠均未發(fā)生冠狀動脈炎，而70%的野生型小鼠和所有B cellnull小鼠發(fā)生了冠狀動脈病變，這進一步表明T細胞在LCWE誘導的KD冠狀動脈炎中起重要作用。

LCWE誘導模型也依賴于完整的Toll樣受體2（toll-like receptor 2，TLR2）和髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）信號以及 IL-1β、IL-6和TNF等促炎細胞因子的釋放[14]。Lee等[15]發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-1和IL-1β在該模型冠狀動脈損傷中發(fā)揮關鍵作用，其冠狀動脈損傷可被IL-1受體拮抗劑阻斷。TNF-α在LCWE誘導的冠狀動脈炎和動脈瘤形成過程中也至關重要[20]，TNF受體的遺傳消耗或TNF信號通路的藥物阻斷可保護小鼠避免血管炎的發(fā)生[15,21]。

LCWE誘導模型也證實了ITPKC在KD發(fā)展過程中的重要作用，ITPKC可通過控制細胞內Ca2+濃度來介導核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding oligomerization domain，Nod）樣受體家族含pyrin結構域蛋白 3（Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）炎癥體的激活、調節(jié)NLRP3的表達及隨后IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，從而影響高危ITPKC基因型患者的治療效果[22]。

2.2 白色念珠菌提取物誘導的KD模型 白色念珠菌是一種條件致病性真菌，在一定條件下可在免疫受損宿主中轉化為誘導炎癥的病原體[5]。有研究認為KD發(fā)病與對流層風模式有關，在KD高發(fā)季節(jié)，對流層與地面氣溶膠的微生物群有很大差異，其中念珠菌是高空樣本中的優(yōu)勢真菌，占所有真菌菌株的54%，表明念珠菌可能是KD的一個致病因素，念珠菌動物模型具有一定可靠性[23]。

1979年，Murata[24]從KD患兒糞便中成功分離出白色念珠菌，并將培養(yǎng)上清液中的白色念珠菌堿性提取物（candida albicans derived substances，CADS）在第 1周和第6周連續(xù)5 d注射入小鼠腹腔，成功誘導了小鼠的冠狀動脈炎，這種動脈炎在組織病理學上與KD患者非常相似。隨后，Takahashi等[25]重復了該實驗，發(fā)現(xiàn)有66%的CD-1小鼠發(fā)生了動脈炎，最常累及部位是冠狀動脈近端區(qū)域和主動脈根部。組織學上，動脈炎特征是典型的增生性和肉芽腫性炎癥，伴有大量巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞和中性粒細胞浸潤，還可觀察到血管內纖維層增厚、內彈性層和中層破壞，與人類KD的冠狀動脈病變類似。

連續(xù)腹腔注射白色念珠菌細胞壁提取物也可誘發(fā)C57BL/6小鼠冠狀動脈、頸動脈、腹腔動脈、髂動脈和腹主動脈等處的炎性病變，且c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）在該模型的血管炎發(fā)展中至關重要，JNK抑制劑可顯著降低小鼠病變的發(fā)生率，并可在組織學上阻止血管炎癥和組織破壞[26]。

2.3 白色念珠菌水溶物（candida albicans water-soluble fraction，CAWS）誘導的KD模型 CAWS是白色念珠菌培養(yǎng)上清液中釋放的水溶性多糖成分，主要由α-甘露糖蛋白和β-葡聚糖復合物組成[27]。

2004年，Nagi-Miura等[27]研究表明，與CADS相比，CAWS誘導小鼠的KD冠狀動脈炎發(fā)病率更高，且不同品系小鼠的冠狀動脈炎發(fā)病率也有所差異，DBA/2、C57BL/6和C3H/HeN品系的所有小鼠均發(fā)生了冠狀動脈炎，其中以DBA/2小鼠冠狀動脈炎最嚴重，死亡率最高，而CBA/J小鼠的冠狀動脈炎發(fā)病率僅有10%。

近年來，許多學者研究了IL-1、TNF、樹突狀細胞相關C型凝集素-2（dendritic cell-associated C-type lectin-2，Dectin-2）和IL-10等在CAWS誘導模型中發(fā)揮的促炎或抗炎作用，具體如下。

IL-1β的釋放需要兩個信號：啟動NLRP3炎癥體誘導NLRP3和前IL-1β的表達，激活炎癥體將前IL-1β切割成成熟形式。CAWS可通過Dectin-2/脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）/JNK/NF-κB 途徑誘導NLRP3炎癥體的啟動，并通過Dectin-2/Syk/JNK/線粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）途徑激活NLRP3炎癥體，而IL-1β-/-、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck like protein containing a caspase recruiting domain，ASC）-/-（ASC參與NLRP3炎癥體的組成）和NLRP3-/-小鼠不會誘發(fā)血管炎，表明NLRP3炎癥體驅動的IL-1β產(chǎn)生是血管炎發(fā)生所必需的[28]，而抗IL-1β抗體可明顯減輕CAWS誘導的血管炎[29]。

KD心臟炎癥的特征是彌漫性心肌炎發(fā)生在冠狀動脈血管炎發(fā)展之前，Stock等[30]重復CAWS誘導模型發(fā)現(xiàn)，TNF和IL-1在KD發(fā)病過程中的作用時機不同，其中TNF在急性心肌炎的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，TNF受體缺陷小鼠不能成功誘發(fā)急性心肌炎。而IL-1對急性心肌炎之后的冠狀動脈炎的發(fā)展至關重要，盡管IL-1-/-小鼠在CAWS誘導后會發(fā)生廣泛的心肌炎，但不會進展為冠狀動脈炎和主動脈炎。

趨化因子配體 2（chemokine ligand 2，CCL2）-趨化因子受體 2（chemokine receptor 2，CCR2）軸在此模型的血管炎發(fā)展中起重要作用，CCR2基因失活對CAWS誘發(fā)的小鼠主動脈炎和冠狀動脈炎具有保護作用[31]。

天然免疫反應也參與了KD血管炎的發(fā)展，在CAWS誘導模型中，心臟成纖維細胞產(chǎn)生的粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte/macrophage colonystimulating factor，GM-CSF）可激活組織巨噬細胞，促進中性粒細胞和單核細胞等免疫細胞向心臟募集，從而導致心臟炎癥，而阻斷GM-CSF可有效阻止心臟炎癥的進展[32]。

Dectin-2是一種C型凝集素受體，Miyabe等[33]研究表明，在CAWS誘導模型中，駐留在主動脈根部的巨噬細胞中的Dectin-2信號可誘導CCL2的產(chǎn)生及主動脈根部和冠狀動脈中CCR2+炎性單核細胞（inflammatory monocytes，IMos）的募集。IMos在血管壁中分化為單核細胞來源的樹突狀細胞并通過Dectin-2/Syk/NLRP3炎癥體依賴途徑誘導IL-1β的釋放。隨后IL-1β激活心肌內皮細胞表達CXC趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、CCL2 和黏附分子，誘導中性粒細胞和IMos在主動脈根部和冠狀動脈中的進一步募集和積聚，從而引發(fā)血管炎癥。在CADS和CAWS模型基礎上，Oharaseki等[34]發(fā)現(xiàn)，在白色念珠菌細胞壁多糖誘導的KD樣血管炎模型中，野生小鼠和Dectin-1-/-小鼠血管炎發(fā)生率為100%，而Dectin-2-/-小鼠均未發(fā)生血管炎，這證實Dectin-2對α-甘露聚糖的識別是白色念珠菌細胞壁多糖誘導的KD樣小鼠血管炎發(fā)病的關鍵。

Nakamura等[35]研究了IL-10在CAWS誘導模型中的作用，發(fā)現(xiàn)GM-CSF可通過上調Dectin-2增加巨噬細胞對CAWS的敏感性。IL-10不能抑制Dectin-2的表達，但可抑制下游細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）-1/2 的 激 活 和 IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達，減少Dectin-2+CD11b+炎癥細胞的浸潤，減輕小鼠主動脈根部和冠狀動脈中的血管炎癥和纖維化，改善心臟功能障礙和致死性，表明IL-10在KD患者治療中具有潛在的應用價值。

2.4 克柔念珠菌細胞壁甘露糖蛋白（mannoprotein，MN）部分誘導的KD模型 基于CADS和CAWS模型的研究基礎，2020年，Yanai等[36]將克柔念珠菌菌株放在天然或化學合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，并提取其MN部分連續(xù)5 d注射入小鼠腹腔，發(fā)現(xiàn)克柔念珠菌MN部分可誘導小鼠產(chǎn)生血管炎，且菌株MN部分在天然培養(yǎng)基中含量更高、活性更強，誘導的冠狀動脈炎更嚴重。

對克柔念珠菌結構進行檢測發(fā)現(xiàn)，其主鏈為α-1,2-、α-1,3-、α-1,6-甘露糖鏈。Dectin-2 是 α-甘露糖特異性凝集素受體，克柔念珠菌MN部分對Dectin-2有強烈反應性，表明克柔念珠菌MN部分存在大量的α-甘露糖結構，與CAWS模型相似，其誘導的血管炎也是通過Dectin-2信號介導的[36-37]。

在27℃的中性pH下制備的CAWS因存在大量β-1,2-甘露糖殘基而不會誘發(fā)小鼠血管炎[38]。與CAWS相似，在克柔念珠菌MN部分的核磁共振譜中也沒有檢測到β-連接甘露糖信號，進一步證實了克柔念珠菌細胞壁MN部分誘導KD血管炎模型的可靠性[36-37]。

Tanaka等[37]比較了不同念珠菌MN部分誘導的DBA/2小鼠血管炎發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)各種念珠菌MN部分誘導小鼠在第200天的死亡率分別為：克柔念珠菌（100%）、白色念珠菌（84%）、都柏林念珠菌（47%）、近平滑念珠菌（44%）、光滑念珠菌（32%）、吉利蒙念珠菌（20%）和熱帶念珠菌（20%），這表明MN部分誘導的KD血管炎強烈依賴于念珠菌的種類和菌株。

2.5 Nod1配體誘導的KD模型 Nod1是一種胞內模式識別受體，可參與許多疾病的炎癥反應，在天然免疫中發(fā)揮重要作用[39]。

2011年，Nishio等[39]通過研究表明，皮下注射或口服FK565（一種合成的Nod1配體）可誘導小鼠產(chǎn)生冠狀動脈炎，且脂多糖可增強FK565的誘導作用。其冠狀動脈炎組織病理學特征為全動脈炎、彌漫性炎性細胞浸潤，主要為中性粒細胞和巨噬細胞，并有冠狀動脈彈性纖維斷裂，不伴有纖維素樣壞死，與KD急性期相似。而Nod1-/-小鼠不能誘導動脈炎的發(fā)生。

在此實驗基礎上，Ohashi等[40]對Nod1配體和CAWS兩種誘導模型進行了比較，他們認為，與CAWS誘導模型中的主動脈根部、主動脈瓣和冠狀動脈的彌漫性炎癥病變不同，Nod1配體誘導模型主要累及雙側冠狀動脈，具有位點特異性，與KD急性期的冠狀動脈炎更為相似，因此Nod1配體誘導的動脈炎模型可能更適于分析KD患者心血管損傷的組織病理學變化，但值得注意的是，與臨床KD患者不同，Nod1配體誘導小鼠并不會導致冠狀動脈瘤的發(fā)生。與CAWS組觀察到的IL-6、IL-13、粒細胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulating factor，G-CSF）、IFN-γ 和 TNF-α 濃度升高不同，Nod1配體組主要表現(xiàn)為IL-1α、IL-1β、IL-5等炎癥因子濃度升高，且IL-1β水平似乎與FK565誘導小鼠的炎癥區(qū)域呈正相關。因此CAWS組和Nod1配體組動脈炎的組織病理學差異可能是由于其不同的細胞因子表達譜。

心臟CD11c+巨噬細胞的積聚在Nod1配體誘導的小鼠急性冠狀動脈炎中起核心作用[41]。嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠可出現(xiàn)較弱但明顯的動脈炎，表明獲得性免疫部分也參與了純Nod1配體引起的炎癥反應[39]。在注射FK565后，脂多糖誘導的RAG-1-/-小鼠仍會發(fā)生大動脈炎和冠狀動脈炎，因此T細胞、B細胞和自然殺傷T細胞在此模型中似乎是非必要的[41]。

2.6 卡介苗（bacillus calmette-guérin，BCG）誘導的 KD模型 BCG接種部位的皮膚損傷是KD患者早期特異性臨床癥狀之一，約30%～50%的KD患者存在BCG接種部位的局部炎癥再活化[42]。

2007年，Nakamura等[43]向C57BL/6J小鼠皮內接種BCG，4周后再次接種胞內分枝桿菌粗提取物（crude extract from Mycobacterium intracellulare，cMI）成功誘導了小鼠的冠狀動脈炎，動脈壁周圍有單核細胞浸潤，而僅接種cMI或BCG的小鼠未發(fā)生冠狀動脈炎。同樣，靜脈注射過氧化還原酶Ⅱ抗體也可誘導小鼠產(chǎn)生冠狀動脈炎，但也僅限于事先接種過BCG后。

隨后，Chun等[44]證實，腹部皮內注射兩次（間隔4周）BCG可誘導程序性死亡（programmed death，PD）-1-/-小鼠產(chǎn)生KD樣特征，包括持續(xù)發(fā)熱5 d以上、腳底紅斑腫脹、尾部皮膚脫屑和膽囊積水，冠狀動脈炎癥細胞聚集和內膜增生、動脈壁水腫，也可觀察到肝動脈、腎動脈和膽管等器官的炎癥反應。同樣，腹部皮內注射兩次（間隔 4周）熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）65也可誘導PD-1-/-小鼠產(chǎn)生與用BCG誘導相似的KD樣特征，表明PD-1基因可能是KD的易感基因之一，含有HSP65結構的抗原可能是KD的觸發(fā)因素。

2.7 牛血清白蛋白誘導的KD模型 2020年，齊雙輝等[45]通過間斷性腹腔注射10%牛血清白蛋白溶液成功誘導了BALB/C小鼠的KD冠狀動脈損傷，其組織學特點為動脈內膜明顯增厚、水腫及變性，內皮細胞排列紊亂，胞質內大量小空泡，周圍炎性細胞浸潤。

3 小結

近年來，國內外學者采用多種誘導劑構建了KD小鼠模型，其中誘導劑以LCWE、CAWS、白色念珠菌提取物等為主，研究方向多在探討各種小鼠模型是否能模擬KD病理過程。雖然各種誘導模型僅能模仿KD的部分臨床特征，目前也尚未建立一種公認可靠的KD小鼠模型，但在KD病因尚不十分清楚、發(fā)病機制尚未完全明確的背景下，小鼠模型仍然是研究人類KD病因、病理和治療等方面的寶貴工具，通過動物模型研究可極大加強人們對KD病理學的理解，推動導致心血管并發(fā)癥的細胞和分子免疫機制的研究，為KD的治療方法提供實驗依據(jù)。