生物檢材中氯氮平分析方法研究進展

徐 翩，張 松

（重慶市公安局a.物證鑒定中心；b.交通管理局,重慶401147）

1 引言

氯氮平（clozapine）系瑞士山德士公司（諾華公司的前身）于1961年研制成功的抗精神分裂癥藥物，屬于二苯并二氮卓衍生物類化合物。臨床試驗表明，氯氮平具有很強的抗精神病作用。此外，它還有緩解疼痛、抑制腎上腺素與去甲腎上腺素導致的升壓等作用，且錐體外系副反應極少，可用于治療急慢性精神分裂癥、癲癇或智能發(fā)育不全所產生的興奮躁動狀態(tài)。然而一部分使用氯氮平治療的精神病人會患有一種名為“粒細胞減少癥”的白血病，嚴重者可在服藥3月后死亡。盡管如此，氯氮平仍然因其低廉的價格及良好的療效占據(jù)我國精神病治療藥的部分市場[1-4]。氯氮平的使用者多為精神病患者，其自控能力較差，意外過量服用導致中毒死亡的事件時有發(fā)生[5,6]。此外，在麻醉搶劫、強奸案件中涉及氯氮平的案例也越來越多[7]；更有甚者，罪犯利用氯氮平投毒的案例亦有報道[8,9]。因此在過去的幾十年中，研究者開發(fā)了各種分析方法檢測氯氮平，包括液相色譜與質譜聯(lián)用法(HPLC-MS)，氣相色譜與質譜聯(lián)用法(GC-MS)和電化學分析檢測方法等。本文以生物樣品為檢材，綜述了近年來氯氮平檢測技術的研究進展。

2 色譜分析法

2.1 薄層色譜法（TCL）

薄層色譜法是根據(jù)分子的極性大小，選擇合適的溶劑作為流動相達到分離、定量目標物的一種層析分離技術。TCL法是毒物分析實驗室使用最為簡便、有效的定性定量分析方法。王清海[10]等在1989年提出了氯氮平在血液中的薄層色譜掃描檢測方法，其中氯氮平掃描線性范圍為0～0.14μg/3μL，最低檢出限為0.1μg/mL。在堿性溶液中(PH=9～12)用乙醚萃取，藥物的回收率達80%以上。TCL方法操作簡便快速，無需復雜的儀器，也不需要專業(yè)的操作人員，因而可以用于氯氮平的現(xiàn)場測定。但由于薄層色譜法常出現(xiàn)假陽性，主要用于高濃度檢材中氯氮平成分的分析。

2.2 氣相色譜法（GC）

氣相色譜法具有高分離性，在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測和食品檢驗等行業(yè)都有廣泛的應用，是氯氮平檢測中常見的方法之一。蘇曉紅[11]等在2009年建立了GC與氮磷檢測器(Nitrogen Phosphorus Detector,NPD)聯(lián)用的方式同時測定胃內容中氯氮平和氯普噻噸的方法，使用該方法對胃內容樣品中氯氮平的定性分析得到了較為滿意的結果，氯氮平的出峰時間為22.987min。王哲焱[12]等在2011年同樣采用GC－NPD聯(lián)用，以SKF－525a為內標來檢測生物檢材中氯氮平的含量。該方法氯氮平的保留時間為7.8 min，且與生物檢材中的雜質峰分離良好，在0.1～48μg/mL內有較好的線性關系，最低檢出限為0.1μg/mL，提取回收率及精密度均達到檢案要求，同時重現(xiàn)性好、靈敏度高，可滿足定性、定量檢驗的分析要求。

2.3 氣相色譜－質譜聯(lián)用法（GC－MS）

與GC相比，GC－MS將GC的高分離能力和MS的高鑒別能力結合起來，用該方法對氯氮平進行檢測也是目前研究者們普遍認可的。國外較早用GC－MS法測定氯氮平的報道是Bondesson[13]在1988年所發(fā)表的，由于CLP分子結構含有胺基，與酰鹵發(fā)生酰基化反應具有反應速度快、反應完全、定量準確的優(yōu)點，且衍生化物中含鹵素能夠達到更低數(shù)量級的檢測限，于是Bondesson采用五氟丙酐(PFPA)作衍生試劑，以Propylnorclozapine為內標測定氯氮平含量。國內則是朱榮華等[14]在1998年首次報道用GCMS測定氯氮平及其去甲代謝產物。以三氟乙酸酐作?；瘎⒁园捕槎績葮?，氯氮平的線性范圍為1～128μg/L，最低檢測濃度為0.1μg/L，回收率大于83%，相對標準偏差小于10%。周海梅[15]等在2003年建立固相萃?。瓪庀嗌V－質譜（SPE－GC－MS）方法測定血液及肝中氯氮平含量。該方法以SKF525a為內標，氯氮平的檢測限為0.05 ng，線性范圍為0.5～100 ng，平均回收率為90.1%。王琦瑋[16]等在2007年采用固相微萃取（SPME）和GC－MS聯(lián)用技術，以洛沙平為內標建立了測定人血漿中氯氮平濃度的方法。標準曲線在5～1000 ng/mL濃度范圍內呈線性關系，氯氮平的定量檢測限為0.1 ng/mL，平均相對回收率高達94.6%～98.6%。此法操作簡便、靈敏度高，適于氯氮平急性中毒的檢測；但由于萃取頭的萃取面積很小，達到平衡時所萃取藥物的絕對量也較少，因此使用SPME法時藥物的提取回收率不高，所以需要選擇與待測藥物化學性質相似的化合物作內標，使兩者的提取回收率相似并保持固定比值，這樣就不會影響定量分析的準確性。曹潔[17]等在2015年將中空纖維膜－液相微萃取(HF－LPME)與氣相色譜－質譜聯(lián)用技術(GC－MS)相結合，建立血液中氯氮平的檢測方法。萃取時選用聚偏氟乙烯中空纖維，血液中氯氮平濃度在0.01 mg/L～5 mg/L范圍內，線性關系良好，檢出限為0.01 mg/L，加標回收率為92.3%～98.8%。該方法操作簡單，所需有機溶劑少，富集效率高，可避免殘留和交叉污染，適于血液中氯氮平的檢測。與TCL相比，GC－MS具有靈敏度高、分離效果好和分析速度快等特點，此法不但適用于氯氮平的定性分析，也適合進行定量分析。

2.4 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法是基于混合物中各組份對兩相親和力的差別進行組份分離，在復雜物質檢材的高效、快速分離分析中發(fā)揮著十分重要的作用，有著其他方法難以取代的地位。HPLC由于其強大的分離能力在氯氮平的檢測中被廣泛應用。王澤人[18]等在1986年首次建立HPLC-UV方法測定氯氮平的血藥濃度，血清樣品用乙醚液液萃取，以安定作為定量的內標物。氯氮平與其代謝產物和內標等出峰快，分離好。該方法最低檢測濃度為5 ng/mL，回收率為100.8%，CV＜5.4%。李琰[19]等在2018年、李慶麗[20]等在2019年均報道過用HPLC測定氯氮平的濃度，他們均采用液液萃取的方式處理樣品，以內標法或外標法來定量。而張文英[21]等在2013年、沈廣虎[22]等在2014年則是采用固相萃取的方式處理樣品，其中張文英等、沈光虎等選用的是在線固相萃取，其余人等選用的離線固相萃取。不論選擇哪種萃取方式，在配合HPLC測定氯氮平含量時都得到了較為滿意的結果。余自成[23]在1998年用HPLC測定人血清中氯氮平濃度時，選用安定為內標，血清樣品用75%三氯乙酸沉淀蛋白后直接進樣檢測，氯氮平的最低檢測限為33.6 ng/mL，線性范圍50.4～1176.0 ng/mL，平均回收率100.9%～102.9%。該方法利用三氯乙酸沉淀蛋白后直接進樣，避免了有機溶劑萃取、轉移、吹干等繁瑣操作；此外，用高濃度三氯乙酸為蛋白沉淀劑，可保證用較少量沉淀劑就能完全沉淀蛋白，避免沉淀劑用量過多對樣本的稀釋，從而保證了直接進樣的檢測靈敏度。金士萍[24]在2015年用HPLC法測定人血漿中氯氮平濃度時，先堿化血漿然后用乙醚液液萃取再分出醚液后離心，最后上清液過固相萃取小柱。此法測定的氯氮平含量亦較為準確可靠。邵紅霞[25]等在2016年采用前處理柱（MAYIODS柱）聯(lián)合在線柱切換高效液相色譜法，血清直接進樣，分析血清中氯氮平的濃度。該方法一方面省去了繁瑣的預處理，另一方面避免生物樣品在預處理過程中成分改變或損失而影響檢測；氯氮平檢測濃度在75～1200 ng/mL范圍內呈良好線性關系，最低定量限為15 ng/mL，方法回收率93.0%～110.5%。

HPLC檢測氯氮平快速靈敏、選擇性好，但此方法需要專業(yè)的化學從業(yè)人員進行操作，不適于作為氯氮平現(xiàn)場分析的方法。

2.5 液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC-MS)

與HPLC相比，使用HPLC-MS對氯氮平進行檢測，兼有HPLC的分離能力和MS的高靈敏度和特異性。秦群[26]等在2004年建立HPLC-ESI+-MS法測定氯氮平血藥濃度，血漿用C18固相萃取小柱進行萃取，以卡馬西平為定量內標，氯氮平最低檢測限為0.2ng/mL，線性范圍為20～2000ng/mL，方法回收率大于95%，日內、日間精密度（RSD）均小于10%。國外則是由Aravagiri[27]在2001年、Tonooka[28]在2018年報道用HPLC-ESI+-MS法測定氯氮平的血藥濃度。此外，王俊偉[29]等在2011年、王瑋[30]等在2018年、陳穎[31]等在2020年又相繼發(fā)表以HPLC-MS/MS法檢測生物樣本中氯氮平濃度的文章。由于串聯(lián)質譜分析儀的靈敏度和選擇性遠高于單級質譜分析儀，故目前多采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀對生物檢材中的氯氮平進行分析。

3 光譜分析法

光譜分析法是基于電磁輻射能與待測物質相互作用后，由產生的輻射信號確定待測物質組成和結構的分析方法。在研究待測物質組成、結構表征等方面具有其他分析方法難以取代的地位，因此對氯氮平的光譜特征研究也是非常有意義的。

3.1 紫外分光光度法

又稱紫外吸收光譜法。根據(jù)物質對不同波長的紫外線吸收程度不同而對物質組成進行分析的方法。楊杰[32]等在1990年應用紫外分光光度法，對6名精神病患者口服氯氮平后的唾藥濃度進行測定，藥物在體內的經(jīng)時過程符合二室開放模型。在相同條件下的同一時間測定氯氮平的血藥濃度與唾藥濃度之比值為1:0.28，兩種濃度呈正相關。然而李煥德[33]在1991年對此法提出了質疑，他結合自己的臨床經(jīng)驗認為氯氮平在唾液中的濃度及用藥劑量等方面均達不到文中的數(shù)據(jù)。

3.2 電荷轉移光度法

徐變珍[34]等在1998年以氯氮平作為電荷給體，7,7,8,8－四氰基對二次甲基苯醌(TCNQ)作為電子受體，用分光光度法研究了它們之間形成電荷轉移(CT)絡合物的條件。結果表明在丙酮介質中，二者于45℃水浴中恒溫1 h即可形成1:1的絡合物，其最大吸收波長為743nm，0～17.5μg/mL范圍內呈線性關系，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=1.60×104L·mol－1·cm－1，方法的相對標準偏差小于1%(n=8)，回收率為99%。該方法得出的結果可靠，為氯氮平含量的分析和測定提供了新的手段。

4 毛細管電泳法

毛細管電泳法是以彈性石英毛細管為分離管道，高壓電場為驅動力的液相分離分析技術。由于毛細管電泳法具有效率高、分析時間短、微量、價格便宜等特點，在氯氮平檢測分析中受到越來越多的關注。張石寧[35]等在2000年首次建立用毛細管區(qū)帶電泳快速測定血清中氯氮平含量的方法。取33.5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PH=6.47)，用紫外檢測器在254 nm波長處檢測，以外標法定量，線性范圍0.1～10μg/ml，最低檢測限0.1 μg/ml。平均回收率(97.47±2.8)%。日內與日間RSD分別為2.63%和3.81%。周大煒[36]等在2004年采用毛細管電泳－迎頭分析模式體外實驗測定了人血清白蛋白溶液、人血漿、兔血清和血漿樣品溶液中游離氯氮平的濃度。毛細血管帶電泳法是快速測定人血清中氯氮平含量的較好方法，但是毛細管電泳法目前僅適用于在實驗室中進行分析，不適合氯氮平的現(xiàn)場檢測。

5 電化學分析法

電化學分析法是依據(jù)物質的電化學性質來測定其組成及含量的分析方法，該方法以其高靈敏度、高選擇性和操作方便等特點，在抗精神病藥物檢測中得到廣泛應用。梁寧剛[37]等在2018年制備了三維石墨烯/L－胱氨酸修飾電極，并用于氯氮平的分析研究中，建立了一種測定氯氮平含量的電化學新方法。目前運用電化學方法進行檢測研究的多采用二維石墨烯[38,39]，但是大部分的方法僅適用于實驗室檢測，未來在技術改進的情況下具有潛在的應用前景。

6 展望

目前對氯氮平的檢測方法有很多，大部分僅局限于實驗室的檢測，而直接用于現(xiàn)場檢測的較少。在氯氮平的檢測方法中，實現(xiàn)對氯氮平的現(xiàn)場檢測將對氯氮平血藥濃度的醫(yī)學監(jiān)測及自殺、投毒等刑事案件的偵破具有重大的意義。生物檢材中氯氮平及其代謝物的分析檢測受到相關從業(yè)者的關注，近年來科學家一直在尋找簡單、靈敏、快速的方法來檢測這些濫用藥物。雖然隨著儀器、設備性能不斷改善，分離技術不斷提高，生物檢材中氯氮平及其代謝物的檢測方法逐步向自動化、快速化和現(xiàn)場化發(fā)展，但每種檢測手段都依然存在著局限性。因此建立快速、準確、高機動性、可現(xiàn)場檢測的體系仍是未來的努力方向。