血管內皮糖萼降解與體外循環(huán)關系的研究進展

葉明棠，丁培成，莫緒明

血管內皮糖萼（endothelial glycocalyx，eGC）是內皮細胞管腔表面的凝膠狀層，由膜結合蛋白聚糖、糖蛋白、胺聚糖和黏附的血漿蛋白組成，它具有血管穩(wěn)態(tài)所必需的多種功能：調節(jié)血管通透性和微血管張力、抑制微血管血栓形成以及調節(jié)白細胞在內皮細胞上的黏附等［1－2］。 在體外循環(huán)（extracorporeal circulation， ECC）期間，由于病理生理損傷的共同效應，糖萼將發(fā)生降解，伴隨ECC 中預充液等醫(yī)源性效應，潛在地加重了這種損傷。 糖萼的降解也被認為是ECC 中導致患者水腫及微循環(huán)障礙的原因［3－4］。 考慮到糖萼降解的病理生理學意義，ECC時流入血液的糖萼降解產物可作為臨床相關生物標志物。 本文擬就eGC 降解與ECC 關系的研究進展做一綜述。

1 eGC 的組成與作用

1.1 eGC 組成與結構 eGC 也稱多糖包被，是由Luft［5］首先于1966 年在電鏡下直接觀察到的一層20 nm 左右的淡藍色熒光物質。 隨著組織固定、染色和成像技術的進步，人們對eGC 的組成和結構有了更加深入的了解，發(fā)現糖萼層主要由蛋白聚糖（proteoglycans，PGs）、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）、膜糖蛋白及血漿蛋白組成，其中PGs 和GAG是其主要組成部分。

PGs 由錨定在內皮細胞頂膜上的核心蛋白和幾條GAG 鏈共價連接到內皮細胞上，包括多配體聚糖－1（Syndecan－1）、 磷脂酰肌醇聚糖及唾液酸。 其中Syndecan－1 作為－核心蛋白通過跨膜結構域依附在血管內皮上，并與硫酸乙酰肝素（heparin sulfate，HS）和硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）相連接，這種結構參與了血管內皮剪切力的轉導［6］；而磷脂酰肌醇聚糖則是通過糖基化磷脂酰肌醇錨定在內皮細胞上，同時與HS 相連，構成了糖萼的“骨架”。

GAG 按照單糖殘基、殘基間連鍵的類型以及硫酸基的數目和位置可分為5 個主要類別：HS（GAG的主要成分，占糖鏈的50%以上）、透明質酸（hyalu?ronic acid，HA）、CS、硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS）、硫酸角質素（keratan sulfate，KS）［7］。 其中含硫成分帶負電荷，使靜電與血漿蛋白相互作用。 相比之下，HA 是一種大型的線性分子，它不與蛋白多糖結合，而是與細胞膜CD44 相互作用。 HA 也不同于其他GAG，因為它不是硫酸鹽，因此是不帶電的。然而，HA 可以與其他硫酸化的GAG 形成復合物，使其能夠固水并穩(wěn)定eGC 的凝膠狀結構［7］。

1.2 eGC 的作用 eGC 在生理條件下主要起著血管通透性的屏障、機械轉導、抗凝血和抗黏附作用。在所有動脈或靜脈血管中，帶負電的乙二醇（ethyl?ene glycol，EG）都參與內皮屏障的選擇性滲透，這種網狀結構限制了帶負電荷和／或大于70 kDa 的分子的跨血管運動，阻止蛋白質和大分子從血液擴散到間隙并通過建立一個跨血管白蛋白梯度。 此外，eGC 有著機械轉導作用，通過感應流體剪切力，并將這些力傳遞給內皮細胞，從而啟動一氧化氮（nitric oxide，NO）介導的血管舒張。 同時，eGC 在內皮細胞表面提供抗凝血和抗黏附作用，它可以保護內皮細胞免受氧化應激。

在ECC 期間，糖鏈部分被降解，不能發(fā)揮其正常功能，這將導致血管通透性增強、組織水腫、白細胞黏附增強、血小板聚集和血管舒張失調。 因此，推測降解導致eGC 功能障礙，恢復eGC 的正常結構是潛在的治療目標。

2 ECC 引起eGC 降解的發(fā)生機制

2.1 ECC 引起 eGC 降解的研究 在 ECC 期間，由于病理生理損傷的共同效應，eGC 發(fā)生降解。 降解的血管內皮層變得更薄更稀疏，允許血漿蛋白（例如白蛋白）和液體穿過血管壁，導致組織水腫形成［3］。 這種降解將 eGC 成分（如 syndecan－1、HS、HA、CS）釋放到血漿中，從而可以從血漿中測得eGC的降解成分來判斷eGC 是否發(fā)生降解。 許多臨床研究表明，ECC 會使患者的 eGC 層厚度降低［3，8］。Nussbaum 等人［9］發(fā)現經 ECC 手術后，灌注邊界區(qū)域顯著增加，表明與術前值相比，術后早期eGC 層厚度減少。

2.2 炎癥誘導的因子參與eGC 降解的研究 許多臨床研究已經證明了炎性細胞因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）－α、白細胞介素（inter?leukin，IL）－1β、IL－6、IL－8 和 IL－10 與 eGC 降解生物標志物之間的聯系［10－11］。 其中，在接受 ECC 下心臟手術患者中，炎性介質TNF－α 和IL－1 與啟動炎性級聯過程相關，促炎細胞因子IL－6 和IL－8 以及抗炎細胞因子IL－10 的炎癥與eGC 降解（血漿syndecan－1 濃度）相關。 Schmidt 等人通過使用 TNF－α 受體 1 缺陷小鼠，證明了 TNF－α 信號是 eGC 降解的必要條件。 這種降解是由乙酰肝素酶激活介導的，因為肺微血管內皮細胞的TNF－α 增加了乙酰肝素酶翻譯后激活和HS 降解的活性。 CB Henry 等人通過對倉鼠的試驗表明：①eGC 大分子滲透增加可能是由TNF－α 處理后的滾動或黏附白細胞破壞所致。 TNF－α 可能激活了白細胞釋放出可以降解eGC 成分的自由基和／或蛋白酶。 TNF－α 還可能激活內皮衍生的自由基或表面結合的蛋白酶或磷脂酶，從而從eGC 中釋放出癸二聚糖或甘氨酸聚糖。一旦激活，白細胞就會在其微絨毛的尖端表達選擇素，并被其在內皮上的配體捕獲。 這將啟動黏附的緩慢滾動階段，并促進隨后的整聯蛋白和Ig 型黏附分子的牢固黏附和外滲。 ②提睪肌中的局部細胞因子池激活了通過的白細胞，然后釋放破壞eGC 的因子。 ③TNF－α 直接刺激內皮細胞，使其脫落 eGC 的某些成分，釋放自由基，或激活降解它的表面結合蛋白酶或磷脂酶。 內皮衍生的金屬蛋白酶是由TNF－α 上調和在內皮形態(tài)。 Yang 等［12］報道了基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）15（ADAM15）在體內和體外作為CD44 胞外域的一種酶。 他們發(fā)現在敲低MMP15 的內皮細胞中，脂多糖處理誘導的CD44 的脫落大大減少。

近來，血管生成素（angiogenin，Ang）－2 被研究為糖萼降解的關鍵介質。 Ang－2 是內皮細胞在炎癥刺激下分泌的蛋白質。 它作為Ang－1 的內在拮抗劑，阻止通常由Ang－1 激活其受體Tie2 誘導的抗炎信號。 Lukasz 等［13］人發(fā)現，使用人臍靜脈內皮細胞系和小鼠，Ang－2 治療引起體內和體外eGC 的快速降解。

雖然炎癥刺激可以引發(fā)eGC 降解，但eGC 的完整性也可以反饋到炎癥過程本身。 例如HS 和syn?decan－1 與細胞表面的趨化因子結合，在降解過程中，釋放的這些趨化因子可能通過促進額外的中性粒細胞募集而放大炎癥。

2.3 過度液體灌注對eGC 降解的影響 數據表明，過度液體灌注可能導致eGC 降解。 高容量血癥與ECC 中eGC 降解增加有關。 幾項臨床前和臨床研究表明，高容量血癥誘導心房釋放心房鈉尿肽（atri?al natriuretic peptide，ANP）以響應機械壁應力，這反過來可能降解 eGC［14］。 Chappell 等人［15］進行了一項試點研究，選擇心肺功能良好的心臟外科患者。他們比較了用6%羥乙基淀粉（hydroxyethyl starch，HES）130／0.4（20 ml／kg；n ＝9）和急性等容血液稀釋（n ＝9），其中抽取的血液量同時被等量的HES 130／0.4 替代。 容積負荷組平均 ANP 水平顯著升高，而等容性組的平均ANP 水平沒有顯著增加。 體積負荷也顯著增加了syndecan－1 和HA 的平均水平，等容組三種生物標志物的平均水平均無顯著升高。

但是，ANP 和eGC 脫落之間的因果關系仍未得到證實。 Hahn 等［16］表明容積負荷僅適度增加血漿NAP 濃度。 此外，還沒有證實 ANP 引起 eGC 脫落的機制。 因此需要進一步研究。

3 檢測eGC 降解的方法

3.1 多糖包被降解的直接床旁成像 正交相譜或側流暗場（sidestram dark field， SDF）成像是活體的顯微鏡成像技術，能夠評估床旁舌下微血管的厚度［17］。 灌注邊界區(qū)域是一個 SDF 測量的參數，SDF測量的參數與多糖包層厚度成反比，已被提出可以代表多糖包層厚度。 但對于舌下微循環(huán)作為臨床相關器官損傷標志物的可靠性和相關性仍存在質疑。因此，還需要進一步的研究。

3.2 循環(huán)生物標志物定量化檢測

3.2.1 Syndecan－1 ECC 會導致內皮 eGC 的脫落。而Syndecan－1 是衡量內皮eGC 脫落的主要指標。Kim 等［18］檢測行ECC 下心臟瓣膜手術后高水平的Syndecan－1 和嚴重急性腎損傷關系，發(fā)現術前血清syndecan－1 的中位濃度為 51（34，88）μg／L，ECC 后增加至 241（140，423）μg／L（P＜0.001）。 Abou－Ar?ab 等［19］分別在手術前、手術后立即入 ICU 和術后第一天對在ECC 下心臟手術的患者采集血樣檢測yndecan－1 值，心臟手術后 syndecan－1 水平顯著升高。 術后水平高于術前水平（ICU 入院時P＝0.001，手術后立即入 ICU 時P＝0.0001）

3.2.2 HS HS 在 ECC 中也有升高的報道。 Wu等［4］檢測30 例行ECC 心臟手術患者術前靜息狀態(tài)、胸骨劈開后、主動脈夾閉后、主動脈開放前5 min、ECC 術后 1 h、ECC 術后 4 h、24 h、48 h 時 syn?decan－1、HS 濃度及 HA 濃度。 發(fā)現 HS 濃度在 ECC后 4 h 時達到峰值（3.1 倍，P＜0.01），并在 ECC 48 h后持續(xù)升高。

3.2.3 HA 在生理條件下，HA 有助于維持 eGC 的結構。 在體外和體內，GAG 降解酶用于評價eGC 的厚度，但這些實驗的結果變化很大，可能是由于所研究的血管的性質和處理條件（酶的性質、暴露的數量和時間）所導致。 例如，將牛睪丸中的細菌肝素酶、軟骨蛋白酶和透明質酸酶注射到大鼠腸系膜后毛細血管小靜脈，分別導致EG 厚度下降43%、34%

和26%（用活體顯微鏡觀察）。 電鏡觀察到，用牛睪丸透明質酸酶處理的大鼠心肌毛細血管EG 厚度減少了58%，而用雙光子激光掃描顯微鏡觀察，同樣處理的小鼠，頸動脈EG 厚度減少25%。 然而，內源性透明質酸酶或血凝素合成酶在EG 血凝素穩(wěn)態(tài)中的作用尚未被證實。

4 抑制ECC 導致eGC 降解的治療進展

4.1 膠體保護eGC 完整性的研究 白蛋白被認為對eGC 具有保護作用。 白蛋白攜帶紅細胞來源的鞘氨醇－1－磷酸（sphingominol－1－phosphate， S1P）到內皮，在那里白蛋白通過抑制MMP 活性介導eGC的恢復［20－21］。 Jacob 等［22］人報道了白蛋白在豚鼠心臟缺血模型中的保護作用。 與未經白蛋白處理的模型相比，經白蛋白處理的模型在冠狀動脈流出物中的合成syndecan－1 和HS 的平均水平顯著降低。

新鮮冰凍血漿（fresh frozen plasma，FFP）對 eGC降解有保護作用。 Kozar 等人［23］證明，與對照組和乳酸林格液組相比，FFP 抑制失血性休克大鼠的eGC 降解。 他們還檢測了從失血性休克大鼠肺組織中提取的syndecan－1 基因的水平。 與對照組相比，失血性休克組syndecan－1 平均mRNA 水平顯著降低（1.39±0.22）。

4.2 抑制ECC 中eGC 降解的應用研究

4.2.1 S1P S1P 是一種鞘磷脂，通過抑制 syndecan－1 的脫落，有助于提高多糖包被的完整性。 S1P 激活S1P1受體，而S1P1受體的激活減弱了MMPs 的活性，導致 syndecan－1 外域脫落［21］。

4.2.2 NO NO 是血管細胞的重要信號分子，低水平的 NO 可以防止氧化細胞損傷。 Bruegger 等［24］發(fā)現在沒有酶促反應破壞eGC 時，再灌注期間施用NO 對eGC 具有保護作用。

4.2.3 蛋白酶抑制劑 凝血酶等蛋白酶已被證實參與多配體聚糖胞外域的切割，抑制蛋白酶活性可起到保護eGC 的作用，所以蛋白酶抑制劑的治療用途具有可能性。 Boels 等［25］研究表明，通過抑制單核細胞趨化蛋白－1 可影響巨噬細胞組織蛋白酶L分泌，從而減少糖萼降解酶乙酰肝素酶的激活。 另有研究表明，抗凝血酶可防止TNF－α 和心臟缺血再灌注引起的eGC 的脫落。

4.2.4 TNF－α 信號抑制劑 TNF－α 僅是炎癥發(fā)展的關鍵介質之一，臨床使用TNF－α 信號傳導抑制劑可顯著減少內毒素引起的eGC 成分脫落、凝血激活和功能性血管功能紊亂。

4.2.5 糖皮質激素 糖皮質激素通過介導內皮一氧化氮合酶的非轉錄激活表現出對缺血－再灌注損傷的保護作用。 除此之外，它還可以通過阻止各種趨化因子和細胞因子的合成來防止炎癥細胞從循環(huán)系統(tǒng)遷移到組織。 皮質類固醇可增加全身血管阻力，并增強兒茶酚胺和血管緊張素Ⅱ的血管收縮反應。 潛在的機制可能涉及下調產生血管擴張劑（如NO 和前列環(huán)素）的酶的表達和活性。 此外，已知糖皮質激素可作用于細胞間連接，以某種方式實現了大分子的跨內皮液流量和細胞旁通透性的降低，因此通常用于預防組織間水腫和腫脹。

4.2.6 成纖維細胞生長因子（fibroblast growth fac?tors，FGF） FGF 是 eGC 生理修復的介質［26］。 它被eGC 降解產生的HS 循環(huán)片段快速激活，并與FGF受體結合，后者傳導信號激活eGC 修復分子，如HS合成的酶反應蛋白－1［27］。

5 結論

eGC 降解作為ECC 病理生理學的一個重要部分，正在得到研究者的重視。 雖然降解的機制尚未完全闡明，但血漿和尿液中eGC 降解成分水平的升高可作為行ECC 手術患兒微循環(huán)障礙及水腫發(fā)生的生物標志物。 進一步的研究來確定如何在ECC期間防止或修復eGC 降解的研究仍需要加強。