兔體外循環(huán)模型心肌代謝組學(xué)研究

鄒麗華，劉晉萍

體外循環(huán)（extacorporeal circulation， ECC）期間主動脈阻斷與開放難以避免心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury， IRI）），可能促進線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放、免疫系統(tǒng)激活、活性氧簇釋放、心肌細胞水腫等［1］，因此 ECC 期間心肌保護策略需關(guān)注ECC 前的心肌代謝準備，改善ECC 誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)心肌氧耗并進行心肌的“訓(xùn)練”［1］。 其中，代謝狀態(tài)作為心肌能量供應(yīng)及功能狀況的反映，可能在ECC 期間發(fā)生復(fù)雜變化，目前臨床常用的心肌保護液－HTK 液，具有酸緩沖能力、含有酮戊二酸可補充能量代謝底物、色氨酸可穩(wěn)定細胞膜等優(yōu)良特性。 前期研究發(fā)現(xiàn)HTK 液可降低主動脈開放后心肌氧耗［2］，但未全面分析心肌代謝變化。 代謝組學(xué)利用分析檢測技術(shù)，如氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography－mass spectrometer，GC－MS）、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用，可對小分子代謝產(chǎn)物進行全面分析，有助于疾病診斷和發(fā)病機制研究［3］。 本研究旨在利用兔 ECC 模型，采用主動脈阻斷與開放、HTK 液心肌灌注，模擬臨床實際，對ECC期間心肌進行代謝組學(xué)分析。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 實驗經(jīng)動物倫理委員會批準（2012－4－10－GZR），選擇 15 ～20 周齡的新西蘭白兔，體重 2～3.5 kg，隨機分為對照組（C 組，n ＝ 6）、缺血組（I 組，n ＝6）、缺血再灌注組（IR 組，n ＝ 6）。 12 只新西蘭白兔作為I 組、IR 組獻血兔用于ECC 管道預(yù)充和術(shù)中輸血，具體方法同前期研究［4］。 實驗動物術(shù)前禁食6 h，禁飲2 h。

1.2 耗材與試劑 ECC 模型采用16 F 靜脈插管、嬰兒型膜肺（Terumo Capiox FX05）、雙頭滾壓泵，心肌灌注管采用20 G 中心靜脈插管。 代謝組學(xué)分析采用氣相色譜儀（Agilent 7890A，美國）、質(zhì)譜儀（Ag?ilent 5975C，美國）、30 m×250 μm×0.25 μm 毛細管柱（Agilent DB－5MS，美國）。 代謝組學(xué)內(nèi)標采用 L－2－氯苯丙氨酸，衍生化試劑采用N，O－雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺。

1.3 ECC 模型建立 入室開通耳緣靜脈，麻醉誘導(dǎo)依次采用芬太尼（3 μg／kg）、戊巴比妥鈉（30 mg／kg）、維庫溴銨（0.1 mg／kg），經(jīng)口氣管插管機械通氣。 麻醉維持采用戊巴比妥鈉、芬太尼、維庫溴銨。右腋動脈置入16 G 套管針，正中開胸，充分暴露心臟和升主動脈，右心耳置入16 F 靜脈插管。 左腋動脈置入20 G 中心靜脈導(dǎo)管入主動脈根部作為心肌灌注。 ECC 管道預(yù)充排氣后開放靜脈引流管、腋動脈插管，開始ECC 轉(zhuǎn)流，肛溫降至30℃阻斷主動脈，灌注 HTK 液 40 ml／kg。 ECC 期間維持肛溫 28℃ 左右，平均動脈壓為40 ～60 mmHg。 主動脈開放前肛溫復(fù)溫至30℃，主動脈阻斷120 min 后松開阻斷帶，恢復(fù)心肌灌注、心臟復(fù)跳，繼續(xù)復(fù)溫至35℃，血流動力學(xué)平穩(wěn)后停機。 I 組主動脈阻斷120 min 后取心肌組織，IR 組主動脈阻斷120 min 開放，心肌恢復(fù)灌注120 min 后取心肌組織。 C 組正中開胸、ECC 插管后取左室心肌組織，心肌標本－80℃冰箱保存，用于代謝組學(xué)檢測。

1.4 代謝組學(xué)GC－MS 檢測 取100 mg 心肌組織，加入 L－2－氯苯丙氨酸（50 μl）、體積比 3 ∶1 的甲醇氯仿混合液（0.5 ml），55 Hz 研磨 7 min 后離心 15 min（4℃，12 000 rpm），取上清行真空濃縮器干燥處理，與80 μl 甲氧胺鹽試劑混勻，37℃孵育 2 h 后加入 100 μl BSTFA，70℃孵育 1 h，冷卻后上機檢測。采用 GC－MS 分析，進樣量為1 μl，氣載為氦氣，氣體入口流速設(shè)為3 ml／min，毛細管柱氣體流速1 ml／min。 初始溫度 80℃ 1 min，以 10℃ ／min 提升至290℃，并維持 290℃15 min。 選擇單純內(nèi)標（L－2－氯苯丙氨酸）、單個樣本進行預(yù)實驗，內(nèi)標保留時間標準差為0.00531，表明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。

1.5 代謝組學(xué)多元數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜峰預(yù)處理去除噪音數(shù)據(jù)，采用最小值二分之一法缺失值模擬，內(nèi)標歸一法數(shù)據(jù)標準化處理。 采用主成分分析法（prin?cipal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法－判別分析（orthogonal projections to latent structuresdiscriminant analysis，OPLS－DA）對數(shù)據(jù)進行多元分析，應(yīng)用得分圖評估樣本分類。 PCA 采用對數(shù)轉(zhuǎn)換及CTR 格式化處理的數(shù)據(jù)標度換算方式，對數(shù)據(jù)進行建模分析。 OPLS－DA 濾除代謝物中不相關(guān)的正交變量，對非正交變量和正交變量分別分析，最大化凸顯模型內(nèi)部與預(yù)測主成分間的差異。 OPLS－DA采用對數(shù)轉(zhuǎn)換及UV 格式化處理的數(shù)據(jù)標度換算方式，對第一、二主成分進行建模分析。 采用7 折交叉驗證檢驗?zāi)Ｐ唾|(zhì)量，R2Y（Y 變量的可解釋性）及Q2（模型的可預(yù)測性）評估模型有效性，排列實驗隨機200 次改變Y 的排列順序獲得Q2值進一步檢驗?zāi)Ｐ陀行浴?/p>

1.6 差異物代謝通路及統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)使用 SIMCA－P 13.0 進行分析，計算 OPLS－DA 第一主成分的變量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP）的閾值，采用 LECO／Fiehn 代謝組學(xué)對代謝物質(zhì)進行鑒定［5］。 所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。 VIP 值＞1 及t檢驗P＜0.05 鑒定差異代謝物。 差異代謝物以 Pearson 相關(guān)系數(shù)進行聚集獲得熱圖，采用MeV 軟件作載荷圖。將差異物在京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（kyoto encyclopedia of genes and genomics database，KEGG）中進行映射，確定代謝通路。

2 結(jié) 果

2.1 代謝組學(xué)多元分析

2.1.1 預(yù)處理結(jié)果 三組心肌組織GC－MS 檢測獲得608 個質(zhì)譜峰，對數(shù)據(jù)進行過濾，去除噪音數(shù)據(jù)，保留583 個峰值（圖1）。

圖1 GC－MS 總離子流圖

2.1.2 PCA 分析結(jié)果 所有樣本處于 95%置信區(qū)間內(nèi)，I 組與C 組PCA 得分圖部分重疊區(qū)分不顯著，R2X＝0.384，Q2＝－0.102。 IR 組與 I 組分布于 T1 兩側(cè)，互不重疊具有聚類趨勢，表明再灌注期間的心肌代謝物質(zhì)可能發(fā)生顯著改變，PCA 模型R2X ＝0.535，系統(tǒng)穩(wěn)定性和實驗可控性良好，數(shù)據(jù)可進一步分析（圖 2～3）。

2.1.3 OPLS－DA 分析結(jié)果 所有樣本處于 95%置信區(qū)間內(nèi)，OPLS－DA 得分圖示I 組與C 組無重疊，R2X＝0.313，R2Y＝0.987，Q2＝ 0.357。 I 組與 IR 組顯著區(qū)分，表明ECC 可引起心肌代謝狀態(tài)的顯著改變（圖 2～3），OPLS－DA 模型 R2X＝0.403，R2Y ＝0.991，Q2＝ 0.714。

圖2 C 組與 I 組 PCA 及 OPLS－DA 得分圖

OPLS－DA 模型行 7 折交叉驗證，I 組與 C 組比較發(fā)現(xiàn)置換檢驗截距分別為 R2＝0.904，Q2＝0.0165，IR 組與 I 組比較發(fā)現(xiàn)置換檢驗截距分別為R2＝0.914，Q2＝－0.0841，OPLS－DA 模型的穩(wěn)健性良好，不存在過擬合現(xiàn)象，OPLS－DA 模型可解釋兩組樣本之間的差異。 缺血期間及再灌注期間代謝物載荷圖見圖4，載荷圖左右兩端物質(zhì)為潛在的差異代謝物。

圖4 缺血再灌注期間代謝物載荷圖

圖3 R 組與 I 組 PCA 及 OPLS－DA 得分圖

2.2 差異代謝物鑒定及代謝通路確定 差異代謝物熱圖表明，缺血期間代謝變化不顯著，僅發(fā)現(xiàn)13個差異物質(zhì)（圖5A），再灌注期間代謝發(fā)生明顯改變，共篩選出82 個差異代謝物（圖5B）。 KEGG 分析發(fā)現(xiàn)缺血期間不飽和脂肪酸油酸代謝上調(diào)，尿嘧啶代謝下調(diào)，包括尿嘧啶核苷、5，6－二氫尿嘧啶生成減少。 尿素循環(huán)相關(guān)產(chǎn)物瓜氨酸、肌酐生成減少，差異代謝物主要參與嘧啶代謝、尿素循環(huán)以及不飽和脂肪酸代謝。 再灌注期間主要涉及氨基酸代謝、不飽和脂肪酸代謝、核苷酸代謝。 再灌注期間上調(diào)的差異氨基酸主要為纈氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、肌氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸。參與氧化應(yīng)激的氨基酸上調(diào)，包括絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸、蘇氨酸，鳥氨酸循環(huán)激活，谷氨酰胺在再灌注期間生成減少。 再灌注期間脂肪酸代謝中十五酸、棕櫚酸（十六酸）、十七酸、硬脂酸（十八烷酸）、茉莉酸甲酯、甘油酸、雙甘油、花生四烯酸、油酸、亞油酸生成增加，其中不飽和脂肪酸花生四烯酸、油酸、亞油酸、茉莉酸甲酯代謝上調(diào)。 再灌注期間核苷酸代謝中尿嘧啶、胞嘧啶核苷、鳥嘌呤、次黃嘌呤、尿酸、黃嘌呤核苷生成增加，羧酸尿嘧啶、胞苷酸、尿苷酸生成減少。 核苷酸代謝產(chǎn)物增加，與黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)相關(guān)的產(chǎn)物次黃嘌呤、黃嘌呤核苷均增加，而參與了ADP 合成的底物腺苷及三羧酸循環(huán)琥珀酸生成減少（圖6）。

圖6 再灌注期間主要差異物代謝通路

3 討 論

ECC 期間受人工管道、低溫等因素的影響，缺血再灌注期間心肌代謝可能發(fā)生顯著改變。 HTK液誘導(dǎo)新陳代謝暫停、維持有利的代謝環(huán)境，防止細胞代謝物的丟失、維持合理的酸堿平衡，防止細胞毒性損傷［6］，但圍術(shù)期心功能紊亂仍常見于臨床，而從心肌代謝角度闡釋可能的機制仍需進一步探索。研究證實ECC 期間心肌腺苷酸發(fā)生顯著改變，ECC可能誘發(fā)了能量受損及恢復(fù)延遲，有學(xué)者采用丙酮酸改善心肌能量代謝［7］。 Mantovani 應(yīng)用微透析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ECC 缺血期間能量代謝（葡萄糖、丙酮酸）下調(diào)，再灌注期間逐漸恢復(fù)。 目前代謝檢測方法由血漿代謝物檢測發(fā)展為微透析檢測，近年來代謝組學(xué)的興起為全面的代謝分析提供了新思路［6，8］，因此本研究采用GC－MS 全面反映ECC 心肌代謝變化特點。 本研究 OPLS－DA 分析發(fā)現(xiàn)經(jīng) HTK 液灌注后缺血期間心肌代謝改變不顯著，再灌注期間代謝發(fā)生顯著差異，KEGG 代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，ECC 再灌注早期氨基酸代謝、核甘酸代謝及不飽和脂胞酸代謝明顯上調(diào)，但同時參與了氧化應(yīng)激的氨基酸、不飽和脂肪酸、黃嘌呤系統(tǒng)均上調(diào)，與腺苷相關(guān)代謝產(chǎn)物及琥珀酸等能量代謝物明顯下調(diào)。

與缺血期相比，心肌再灌注后氨基酸代謝產(chǎn)物明顯增加，可能與ECC 期間能量代謝物相對缺乏、促進白質(zhì)分解有關(guān)。 既往研究發(fā)現(xiàn)在缺血等病理狀態(tài)下，心肌代謝重構(gòu)，氨基酸可作為能量底物的直接來源，參與葡萄糖代謝酶的活性，同時氨基酸攝取增加以抵消氧利用率降低對細胞的有害影響［9］，本實驗中采用HTK 液及低溫進行心肌保護，未檢測到缺血期間氨基酸代謝顯著下調(diào)，表明缺血期間HTK液、低溫等因素可能具有較好心肌保護效果。 此外，氨基酸可改善氧化應(yīng)激，抵消氧自由基的作用，氧自由基是谷胱甘肽合成的前體，或一氧化氮生物合成的底物［9］，其中絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸、蘇氨酸被證實參與氧化應(yīng)激，再灌注期間顯著增加，參與抗氧化應(yīng)激的谷氨酰胺明顯下降，與既往研究一致，因此改善ECC 再灌注期間心肌保護可能仍需進一步降低氧化應(yīng)激損傷。

核苷酸代謝與心肌能量代謝、氧自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)，其中黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)是參與心肌IRI機制中的氧自由基主要來源［10］。 缺血期間ATP 分解，產(chǎn)生大量次黃嘌呤和黃嘌呤，再灌注血供和氧供的恢復(fù)促進黃嘌呤氧化酶生成尿酸，同時釋放大量O2

－產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷［11］，本研究中再灌注期間次黃嘌呤、尿酸、黃嘌呤核苷顯著上調(diào)，推測氧自由基可能是兔ECC 模型再灌注損傷重要機制。 此外，腺苷代謝物及琥珀酸明顯下調(diào)，證實ECC 期間心肌可能存在能量轉(zhuǎn)移、利用以及生成障礙。

ECC 期間不飽和脂肪酸代謝上調(diào)，其上調(diào)可能與ECC 期間交感神經(jīng)興奮激活β 受體有關(guān)。 本研究發(fā)現(xiàn)，油酸在缺血期間增加、再灌注期間進一步增加。 油酸分解耗氧較多，缺血期間心肌氧供驟減使得油酸分解下降，且心肌缺血期間對脂肪酸利用減少進而引起油酸的相對升高。 花生四烯酸為脂質(zhì)過氧化物的主要來源，前期研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化物終產(chǎn)物不飽和醛參與了ECC 期間的心肌損傷，醛類在心肌缺血期間堆積，再灌注期間水平降低但再灌注早期顯著高于術(shù)前，因此不飽和脂肪酸的上調(diào)可能參與了ECC 期間醛類堆積及心肌損傷的重要機制，與前期研究結(jié)果一致［12］。 既往研究結(jié)果證實，心肌缺血再灌注期間脂肪酸β 氧化的增強，但脂肪酸β氧化增強與心肌能量代謝改善不呈正相關(guān)，可能的機制為脂肪酸β 氧化加速使ATP 產(chǎn)生增多，但同時再灌注期間耗氧增加，因此心肌能量仍處于失衡狀態(tài)，與本研究結(jié)果一致，本研究觀察到再灌注期間腺苷相關(guān)代謝物及琥珀酸顯著下調(diào)。

綜上所述，本研究全面分析了ECC 期間心肌組織的代謝特點，發(fā)現(xiàn)ECC 再灌注期間氨基酸代謝上調(diào)、不飽和脂肪酸生成增加、黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)活化，本研究從心肌代謝角度探索可能心肌IRI 機制，將有助于減輕缺血再灌注損傷策略改進。