PCR技術(shù)在衛(wèi)生防疫領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展

李雅微 孟然 衣琳

[摘要]聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)可通過體外酶促擴(kuò)增特定的DNA片段、RNA片段開展生物學(xué)相關(guān)檢查或者病原微生物檢查，具有敏感性高、監(jiān)測(cè)速度快、特意性高等特點(diǎn)，在衛(wèi)生防疫領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。因此，本文特對(duì)衛(wèi)生微生物檢測(cè)、病毒檢測(cè)等衛(wèi)生防疫領(lǐng)域中PCR技術(shù)的應(yīng)用情況進(jìn)行總結(jié)，同時(shí)探究PCR技術(shù)在未來衛(wèi)生防疫領(lǐng)域中的應(yīng)用展望。

[關(guān)鍵詞]衛(wèi)生防疫領(lǐng)域;PCR技術(shù);應(yīng)用進(jìn)展

[中圖分類號(hào)]R197.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2096-5249（2021）23-0206-02

近年來，隨著我國人們經(jīng)濟(jì)水平的大幅提升，廣大人群群眾對(duì)公共衛(wèi)生問題的關(guān)注度也逐漸增加，衛(wèi)生防疫領(lǐng)域也成為近年來的熱點(diǎn)話題，為日常監(jiān)督檢測(cè)、應(yīng)急事件的預(yù)防與處理、重大共衛(wèi)生事件、進(jìn)出口檢驗(yàn)等多個(gè)方面工作開展均提出了更高的考驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[1]。PCR技術(shù)具有特異性、快速型、敏感性、操作簡單等優(yōu)勢(shì)，是臨床常用的檢驗(yàn)方式，在衛(wèi)生監(jiān)督與疾病預(yù)防控制體系的完善建立方面具有重要意義。近年來，隨著臨床技術(shù)的進(jìn)一步推薦與完善，PCR技術(shù)也有所改良與延伸。因此，本文對(duì)衛(wèi)生防疫領(lǐng)域中PCR技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行深入研究。

1衛(wèi)生微生物檢測(cè)領(lǐng)域中PCR技術(shù)的應(yīng)用

1.1食品檢驗(yàn)衛(wèi)生微生物檢測(cè)技術(shù)更重視群體性研究，檢測(cè)范圍較廣，多用于對(duì)外界環(huán)境中存在的非致病性微生物、致病性微生物含量進(jìn)行檢測(cè)。食品安全一直是人們關(guān)注的重要民生問題，一旦人們誤食不潔、過期或者含有致病菌的食品，輕則出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)也會(huì)因食物中毒喪失生命。食品檢驗(yàn)直接關(guān)系著人們的生命健康，因此，加強(qiáng)對(duì)食品中含有的有害病菌的篩選與檢測(cè)，避免食物污染，有效控制食品中的衛(wèi)生微生物，特別是各類傳染病、各種致病菌的蔓延[2]。以往臨床多選用細(xì)菌培養(yǎng)、血清分型、生化鑒定等方式，具有價(jià)格低廉，經(jīng)濟(jì)適用性高等特點(diǎn)，但是上述方法的檢測(cè)時(shí)間長，一般需要花費(fèi)1～2周方可獲取檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)檢查操作復(fù)雜，靈敏度較低，對(duì)人力與時(shí)間均存在一定的損耗。PCR技術(shù)則因操作簡單、檢測(cè)敏感性與特異性高，檢驗(yàn)結(jié)果獲取時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，在食物中毒等突發(fā)危及時(shí)間處理中可通過快速檢測(cè)，對(duì)患者的過敏源進(jìn)行確認(rèn)，以便快速開展應(yīng)急處理工作，挽救患者的生命安全[3]。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Lm）是一種胞內(nèi)寄生菌，分布較為廣泛，肉制品、牛乳、魚類、蔬菜等污染食品內(nèi)普遍存在可經(jīng)口感染，其中主要的致病因子、侵襲因子為李氏溶血素O基因、內(nèi)毒素基因，均存在于染色體內(nèi)。利用PCR技術(shù)對(duì)食品中含有的Lm進(jìn)行檢查時(shí)，進(jìn)行對(duì)李氏溶血O基因進(jìn)行擴(kuò)增，12h內(nèi)即可完成檢測(cè)。金黃色葡萄球菌腸毒素（SE）可誘發(fā)食物中毒，TssT1毒素可誘發(fā)中毒休克綜合征，ETA、ETB等脫皮毒素與膿包性葡萄球菌感染存在密切關(guān)系。開展PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)產(chǎn)毒基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，可短時(shí)間內(nèi)對(duì)葡萄球菌毒株檢出，多個(gè)樣品可在一次檢測(cè)內(nèi)完成，且對(duì)菌株的活性無特殊要求，具有較高的敏感性與特異性。根據(jù)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[4]，食品中沙門氏菌檢測(cè)時(shí)，可根據(jù)腸炎沙門氏菌C7克隆株的2.1kbhindIII片段特異性設(shè)計(jì)引物進(jìn)而快速檢出，利用PCR技術(shù)檢測(cè)時(shí)敏感性、特異性均可達(dá)到100%。利用PCR技術(shù)檢測(cè)腸出血性大腸桿菌時(shí)，通過對(duì)采集的樣本進(jìn)行增菌處理，通過快速裂解吸附法制備檢測(cè)模板，對(duì)EHEC三種毒力基因進(jìn)行同時(shí)監(jiān)測(cè)，包括腸上皮細(xì)胞纖毛消除素基因eaeA、志賀樣毒素基因sit1/2溶血素基因hlyAB、。相應(yīng)擴(kuò)增片斷依次為1109bp、302bp、228bp，臨床檢驗(yàn)時(shí)可使PCR技術(shù)的特異性更高。對(duì)食品中含有的EHEC進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，整個(gè)過程可控制在8h以內(nèi)，敏感性高，但是樣品限度在≤1.6cfu/g（ml）。1.2病毒檢測(cè)我國作為乙型干預(yù)的高發(fā)國家，乙肝對(duì)我

國人們健康安全存在極大危害。因此，利用PCR技術(shù)對(duì)乙肝病毒進(jìn)行檢測(cè)，及時(shí)確診并為患者提供有效治療，可最大程度挽救患者的生命安全。HBV核心或整合形式等HBV異常物質(zhì)DNA，多在肝細(xì)胞染色體內(nèi)存在，利用PCR檢測(cè)技術(shù)時(shí)，可通過HBV-DNA作為傳染性的直接反應(yīng)指標(biāo)。檢測(cè)時(shí)HBAa呈現(xiàn)陽性反應(yīng)時(shí)，提示乙肝病毒存在復(fù)制活性較高，傳染性較強(qiáng)，而檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)陰時(shí)，則提示乙肝病毒的復(fù)制活性逐漸減弱，且傳染性也大幅降低，但是此時(shí)無法保障不具備傳染性[4]。近年來，臨床通過對(duì)HBeAg陰性的從業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，抽取的血清樣本中仍存在HBV-DNA。因此，相比于血清檢測(cè)，PCR技術(shù)檢測(cè)的敏感性更高，可作為乙肝病毒有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

PCR技術(shù)不僅可對(duì)食品中含有的致病菌進(jìn)行檢測(cè)，也可用于檢測(cè)環(huán)境水質(zhì)、水產(chǎn)品中含有的致病菌。病毒學(xué)指標(biāo)在水產(chǎn)品衛(wèi)生檢測(cè)、環(huán)境水質(zhì)檢測(cè)方面具有重要意義，可對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒、埃可病毒、柯薩奇病毒A與B、輪狀病毒等進(jìn)行有效檢測(cè)，檢出率較高。對(duì)Taq酶檢測(cè)時(shí)利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，可通過以RNA作為擴(kuò)增目標(biāo)時(shí)，可通過反轉(zhuǎn)錄，獲取cNDA，然后再次開展PCR擴(kuò)增檢測(cè)。相比于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法而言，反轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)病毒的檢測(cè)敏感率更高，約在10～1000倍左右。在實(shí)際河水、海水等環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)時(shí)，多利用RT-PCR技術(shù)對(duì)甲肝病毒進(jìn)行檢測(cè)，主要是通過免疫磁珠分離，套式逆轉(zhuǎn)錄后，開展PCR技術(shù)，可有效提升檢測(cè)效率。應(yīng)用多重引物PCR擴(kuò)增法時(shí)，也可對(duì)環(huán)境標(biāo)本中的甲肝病毒進(jìn)行檢測(cè)[5]。抗原捕獲PCR技術(shù)也是對(duì)水樣本中病毒檢測(cè)的常用檢測(cè)方式，但是檢測(cè)限的病毒顆粒僅為4個(gè)，而應(yīng)用巢式PCR技術(shù)時(shí)病毒顆粒的檢測(cè)限在1～10個(gè)區(qū)間內(nèi)。

PCR技術(shù)也可對(duì)SAPS病毒進(jìn)行檢測(cè)。目前，SARS冠狀病毒的基因組已被全部測(cè)定知曉，利用PCR作為基礎(chǔ)化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)時(shí)，可迅速被開發(fā)，而SARS病毒基因組也作為公共健康策略中PCR化驗(yàn)中的重要組成部分。現(xiàn)今，在食品、動(dòng)植物、農(nóng)副產(chǎn)品中檢測(cè)是否存在SARS病毒時(shí)，僅需技術(shù)人員利用實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)檢測(cè)儀僅需操作即可，即可快速判斷。

2在轉(zhuǎn)基因食品與PCR產(chǎn)物檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著PCR技術(shù)的不斷成熟完成，在分子生物學(xué)、食品分析中的應(yīng)用越來越廣泛。轉(zhuǎn)基因食品是近年來熱議的話題，主要是通過基因工程技術(shù)將有利基因轉(zhuǎn)移至微生物、植物、動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，使被轉(zhuǎn)移的研究對(duì)象獲取人們想要的有利特性，并將獲取的轉(zhuǎn)基因物種或處理，獲取獲取的食品與添加劑，達(dá)到改善食品營養(yǎng)成分、提高產(chǎn)量、延長保質(zhì)期等目的。相比于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，轉(zhuǎn)基因食品的安全性更受到人們的關(guān)注與重視?，F(xiàn)今食品開展GMOs監(jiān)測(cè)時(shí)，選用安全性高的檢測(cè)技術(shù)與方法，是提升管理與審批工作效率的重要環(huán)節(jié)[6]。PCR作為現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因食品安全的最佳檢測(cè)方式，可通過對(duì)特定序列進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全性進(jìn)行確定，序列包括三類：第一類為調(diào)控序列，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食物內(nèi)是否含有GMOs時(shí)，可對(duì)CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)行確定，檢測(cè)限在0.1%以內(nèi)，即食品含量中的GMOs檢測(cè)含量在0.1%時(shí)即可定性。第二類為標(biāo)記序列，多用于對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的篩選工作以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定工作，主要是標(biāo)記抗生素抗性基因。第三類為目的基因，即轉(zhuǎn)入基因，例如抗除草劑基因、抗蟲基因，利用PCR技術(shù)對(duì)植株中的目的基因進(jìn)行檢出，可為轉(zhuǎn)基因食品的篩選鑒定、安全性評(píng)估等工作開展提供高敏感性的直接數(shù)據(jù)指導(dǎo)，是現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因食品安全性檢測(cè)的重要技術(shù)手段。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)時(shí)可利用PCR技術(shù)并與電泳檢測(cè)、基因探針等方式結(jié)合檢查，可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特意性序列分析，開展定性檢驗(yàn)，檢查結(jié)果以“有”、“無”進(jìn)行表現(xiàn)。在食品、化妝品等對(duì)致病菌要求為無的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，利用此聯(lián)合檢查方式，可準(zhǔn)確判斷檢測(cè)物內(nèi)是否含有致病性微生物。PCR產(chǎn)物檢測(cè)方式較多，包括核酸分子雜交、凝膠電泳、酶譜分析、核苷酸序列分析、免疫檢測(cè)、顏色互補(bǔ)分析等[7]，在實(shí)際檢驗(yàn)中需根據(jù)研究對(duì)象、目的的差異科學(xué)選擇不同的檢驗(yàn)方式，其中最為常用的監(jiān)測(cè)方法為凝膠電泳法。

3PCR技術(shù)的展望

PCR技術(shù)從理論方面而言，可對(duì)DNA分子快速擴(kuò)增至所需監(jiān)測(cè)量，即使樣本中僅存在1個(gè)靶細(xì)胞也可有效檢出，達(dá)到fg值。由于實(shí)際監(jiān)測(cè)過程中外界環(huán)境存在多樣化，內(nèi)涵的微生物種類存在復(fù)雜性、不穩(wěn)定性，導(dǎo)致衛(wèi)生微生物檢測(cè)中應(yīng)用PCR技術(shù)存在一定的檢出難度。樣本中理化性質(zhì)干擾、樣本采集與分離靶細(xì)胞過程、、外源性DNA污染、DNA與RNA提取時(shí)暴露等原因，均會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在一定差異，導(dǎo)致PCR檢測(cè)結(jié)果的特異性、靈敏度降低[8]。因此，PCR技術(shù)在食品檢測(cè)運(yùn)用時(shí)，可純化提取方式，對(duì)食品中含有致病菌的NDA提取方式開展進(jìn)一步的探索，并將研究目標(biāo)轉(zhuǎn)入到靶基因檢測(cè)中，提升檢出率。在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中也需將PCR技術(shù)運(yùn)用于病原體鑒定當(dāng)中，發(fā)揮快速溯源的優(yōu)勢(shì)。在衛(wèi)生防疫檢疫中應(yīng)用PCR技術(shù)，應(yīng)在疾控中心內(nèi)設(shè)立分析生物實(shí)驗(yàn)室，并不斷加強(qiáng)對(duì)PCR技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域與方面的深入研究，以保證PCR技術(shù)可稱為最強(qiáng)的衛(wèi)生防疫武器，為我國衛(wèi)生防疫事業(yè)有序開展奠定良好基礎(chǔ)。

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