MALDI—TOF—MS技術(shù)在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用進(jìn)展

張青宜

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2014.11.1

摘 要 蛋白質(zhì)是人類(lèi)執(zhí)行生命活動(dòng)的直接載體，對(duì)于蛋白質(zhì)的深入研究，不但有助于全面闡釋生命活動(dòng)的本質(zhì)，而且對(duì)于研究疾病發(fā)生機(jī)制、提前預(yù)警以及診斷疾病、療效的預(yù)后預(yù)測(cè)均具有重要意義?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中經(jīng)常用到的質(zhì)譜研究技術(shù)之一，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床研究?，F(xiàn)就其在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

關(guān)鍵詞 MALDI-TOF-MS 血液系統(tǒng)疾病 應(yīng)用進(jìn)展

Application progress of MALDI-TOF-MS technology in the blood system diseases

Zhang Qingyi

Department of Hematology，the People's Liberation Army General Hospital（Beijing） 100853

Abstract Protein is the direct carrier of human life activities.For depth research on protein，it not only helps to explain the essence of life activity，but also have important significance on the study of the mechanism of diseases，early warning，diagnosis of the disease and the prediction of curative effect.At present，matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS） technology is one of the frequently used mass spectrometry techniques in proteomics research.It has been widely used in clinical research.We summarize the application progress of it in the blood system diseases.

Key words MALDI-TOF-MS；Blood system diseases；Application progress

對(duì)于蛋白質(zhì)的深入研究，不但有助于全面闡釋生命活動(dòng)的本質(zhì)，而且對(duì)于研究疾病發(fā)生機(jī)制、提前預(yù)警以及診斷疾病、療效、預(yù)后預(yù)測(cè)均具有重要意義[1]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中經(jīng)常用到的質(zhì)譜研究技術(shù)之一，從中可以尋找疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物[2]。近年來(lái)已有多位學(xué)者將其應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病的診斷及監(jiān)測(cè)中，現(xiàn)就其在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

MALDI-TOF-MS技術(shù)

技術(shù)組成：主要有三部分構(gòu)成：①基質(zhì)：主要作用是在吸收激光能量同時(shí)使待測(cè)的樣品分子轉(zhuǎn)化成離子，即樣品分子的離子化。②基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI）：MALDI的作用原理是樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜受到激光照射后，基質(zhì)吸收激光能量并將其傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，從而使生物分子電離。③飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）：TOF的作用原理是氣化狀態(tài)下的離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間。

基本原理：將磁珠分選后的含有微量蛋白質(zhì)的樣本分散在過(guò)量的小分子基質(zhì)中，將混合液體點(diǎn)到樣品靶上，靜置風(fēng)干后放入離子源內(nèi)；當(dāng)靶點(diǎn)受到激光照射時(shí)，基質(zhì)吸收激光的能量躍遷到激發(fā)狀態(tài)，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離和氣化，在高電壓場(chǎng)內(nèi)，將電離的樣品分子從離子源轉(zhuǎn)送到質(zhì)量分析器內(nèi)，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同（即通過(guò)離子的質(zhì)量電荷之比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比來(lái)分析離子，并測(cè)得樣品分子的分子量），經(jīng)離子檢測(cè)器及計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理得到肽質(zhì)量指紋圖譜。由于每種蛋白質(zhì)都有不同的氨基酸序列（一級(jí)結(jié)構(gòu)），蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生的肽片斷序列也不全相同，其肽混合物質(zhì)量數(shù)具有特征性。比較質(zhì)譜分析中所得的肽質(zhì)量指紋譜與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)的理論肽段，就可以對(duì)所測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。

MALDI-TOF-MS在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

急性白血?。杭毙园籽∈菄?yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性血液系統(tǒng)疾病之一，目前發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)。早發(fā)現(xiàn)、早診斷可以進(jìn)行早期干預(yù)疾病進(jìn)程，對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義。目前已經(jīng)有多位學(xué)者將MALDI-TOF-MS技術(shù)應(yīng)用于急性白血病的診斷。鄭瑞璣等[3]應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)研究了51例急性白血病患者和10名健康志愿者的外周血血清蛋白質(zhì)譜的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)急性白血病患者外周血血清中存在多種蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，其中血清外源性凝集素的表達(dá)差異可作為初診急性白血病診斷標(biāo)志或者預(yù)后指標(biāo)。田帥等[4]應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)研究了急性髓系白血病（AML-M2a）患者誘導(dǎo)治療前與復(fù)發(fā)者首次持續(xù)完全緩解時(shí)間具有明顯差異的白血病細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，質(zhì)譜鑒定了6個(gè)差異蛋白質(zhì)，分別為微管蛋白特定分子伴侶B、髓過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)膠蛋白2CH結(jié)構(gòu)域、谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶、鋅酯蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)。崔久嵬等[5]同時(shí)利用MALDI-TOF-MS技術(shù)研究了急性非淋巴細(xì)胞白血?。ˋNLL）與急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組表達(dá)情況，差異表達(dá)蛋白中髓系相關(guān)蛋白8和14不僅可以作為區(qū)別ANLL和ALL的分子標(biāo)志，還可以區(qū)分ANLL細(xì)胞的分化階段；Op18、熱休克蛋白27等還可以作為新的分子標(biāo)志區(qū)分ANLL和ALL。

MALDI-TOF-MS技術(shù)不僅應(yīng)用于急性白血病的分類(lèi)診斷，也可用于判斷疾病療效、微小殘留病變檢測(cè)、鑒別白血病細(xì)胞的耐藥性。梁婷婷[6]等采用基于磁珠分離的MALDI-TOF-MS技術(shù)研究了30例初發(fā)急性白血病及其治療緩解后血清標(biāo)本，并獲得血清多肽譜圖，共得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）的差異峰27個(gè)，其中治療緩解后表達(dá)上調(diào)峰及下調(diào)峰分別為10個(gè)和17個(gè)，利用上述差異峰建立的診斷模型獲得了100%敏感性和90%的特異性，認(rèn)為該項(xiàng)技術(shù)可用于急性白血病療效評(píng)價(jià)和發(fā)病機(jī)制研究。宋偉等[7]利用血清多肽圖譜技術(shù)篩查出質(zhì)荷比（m/z）為4468的多肽在初治AL患者中表達(dá)明顯增高，而良性血液病患者中未見(jiàn)此現(xiàn)象，認(rèn)為其可以用于AL患者M(jìn)RD的檢測(cè)、個(gè)體化治療及預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)。

多發(fā)性骨髓瘤：多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種起源于B淋巴細(xì)胞的漿細(xì)胞惡性腫瘤，其診斷目前需依靠臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)等協(xié)同判斷，基于單一實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較難作出診斷。目前已有多位學(xué)者將MALDI-TOF-MS技術(shù)應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤臨床研究中，He A應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)研究了48個(gè)MM患者及74個(gè)健康人的血清樣本，鑒定出的4個(gè)具有高分離特征的譜峰組成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型，驗(yàn)證階段的敏感性86.36%及特異性87.5%[8]。房亞哲等[9]通過(guò)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓上清液、血清及尿液研究后，成功篩查出與MM相關(guān)的多種差異表達(dá)蛋白，為進(jìn)一步研究MM發(fā)生發(fā)展機(jī)制，完善MM診斷、鑒別診斷提供了參考依據(jù)。難治復(fù)發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤患者大多與多藥耐藥現(xiàn)象相關(guān)，如何提前預(yù)知腫瘤細(xì)胞耐藥并適時(shí)調(diào)整用藥方案是當(dāng)前臨床遇見(jiàn)的難題。王劍利等[10]利用MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)比分析臨床上難治復(fù)發(fā)與治療敏感的多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者血清蛋白質(zhì)組的差異，共得到59個(gè)有明顯差異的多肽峰，將其中的10個(gè)質(zhì)譜峰建成診斷遺傳算法模型，其驗(yàn)證的靈敏度及特異性均100%，認(rèn)為該方法可用于研究多發(fā)性骨髓瘤的耐藥機(jī)制和臨床預(yù)后判定。

骨髓增生異常綜合征：骨髓增生異常綜合征（MDS）是以骨髓無(wú)效造血及高危轉(zhuǎn)化為急性白血病為臨床表現(xiàn)的一組異質(zhì)性克隆性疾病，臨床表現(xiàn)與部分巨幼細(xì)胞性貧血、再生障礙性貧血、溶血性貧血相似，診斷主要依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)相結(jié)合，尚未發(fā)現(xiàn)特異性的生物標(biāo)志物。鐘立業(yè)等[11]利用MALDI-TOF-MS技術(shù)研究了16例MDS患者及10例正常人的血清蛋白標(biāo)本，利用12個(gè)有差異的蛋白峰建立起一個(gè)MDS診斷模型，其識(shí)別準(zhǔn)確率和交叉驗(yàn)證敏感性分別達(dá)93.27%和89.94%，可以區(qū)分MDS與正常人，有助于MDS的臨床輔助診斷。鐘立業(yè)等還研究了RAEB型MDS、急性髓性白血?。ˋML）和正常人的血清蛋白標(biāo)本各10例，通過(guò)MALDI-TOF-MS測(cè)定標(biāo)本的蛋白質(zhì)譜圖，對(duì)比分析差異蛋白峰，并構(gòu)建診斷模型，驗(yàn)證結(jié)果顯示模型的MDS識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)100%，敏感性達(dá)89.42%，認(rèn)為利用MALDI-TOF-MS技術(shù)能夠有效地區(qū)分RAEB患者、AML患者和正常人。根據(jù)血清差異蛋白質(zhì)的組合峰所構(gòu)建的診斷模型可輔助RAEB型MDS的診斷[12]。

鐮狀細(xì)胞貧血：MALDI-TOF-MS技術(shù)不僅在惡性血液系統(tǒng)疾病診斷、預(yù)后判斷發(fā)揮作用，在其他血液系統(tǒng)疾病中也有深入研究應(yīng)用。鐮狀細(xì)胞貧血（SCDs）屬于遺傳性血紅蛋白病之一，新生兒血紅蛋白病的篩查通常是利用敏感的電泳和等電聚焦電泳技術(shù)來(lái)確定異常的血紅蛋白。目前該類(lèi)疾病的常規(guī)新生兒篩查受科技及經(jīng)濟(jì)局限在多數(shù)國(guó)家并未執(zhí)行，經(jīng)常優(yōu)選的方法是種族靶向新生兒篩查，不利于大面積擴(kuò)展。Hachani J等[13]應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)844例Guthrie卡上的新生兒干燥血凝塊樣本進(jìn)行了回顧性研究，并從每1例干血斑樣本中檢測(cè)的1000個(gè)質(zhì)譜中選取4個(gè)差異蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果以MALDI-TOF-MS為基礎(chǔ)的篩查方法與傳統(tǒng)方法相比結(jié)果具有高度相關(guān)性，支持MALDI-MS技術(shù)可作為通用的篩查方法對(duì)SCDs新生兒進(jìn)行篩查，具有高通量、經(jīng)濟(jì)、高敏感性及能夠自動(dòng)區(qū)分鐮狀血紅蛋白等特點(diǎn)。

討 論

2001年開(kāi)始的蛋白質(zhì)組學(xué)研究開(kāi)創(chuàng)了后基因組研究的新時(shí)代。血液蛋白質(zhì)組學(xué)研究是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究重點(diǎn)領(lǐng)域之一。以MALDI-TOF-MS技術(shù)為主要手段的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病的研究中，其具有準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好、靈敏度高、重復(fù)性好、高通量等特點(diǎn)，不但可以用于惡性血液病的診斷、發(fā)病機(jī)制、療效及預(yù)后判斷方面的研究，在良惡性血液疾病鑒別診斷方面也將發(fā)揮重大作用。未來(lái)隨著新的質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，蛋白質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中必將發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

參考文獻(xiàn)

1 楊澤松，陳建斌.蛋白質(zhì)組學(xué)在白血病中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（7）：1365-1368.

2 姚東，陳文虎，鄭智國(guó)，等.WCX納米磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS研究正常人血清蛋白指紋圖譜的年齡與性別差異[J].腫瘤學(xué)雜志，2010，16（8）：644-647.

3 鄭瑞璣，馬旭東.急性白血病血清蛋白質(zhì)譜特征研究[J].中華血液學(xué)雜志，2013，34（5）：426-429.

4 田帥，孟凡義，唐加明，等.急性髓系白血病M2a骨髓細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析及其預(yù)后意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87（8）：538-541.

5 崔久嵬，王冠軍，李薇，等.急性非淋巴細(xì)胞白血病與急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2005，9（4）：498-501.

6 梁婷婷，王娜，王冠軍，等.基于磁珠分離的生物質(zhì)譜技術(shù)用于急性白血病療效評(píng)價(jià)[J].分析化學(xué)，2010，38（2）：233-236.

7 宋偉，李薇，王冠軍，等.利用血清多肽圖譜技術(shù)篩查急性白血病微小殘留病檢測(cè)的標(biāo)志物[J].中華血液學(xué)雜志，2013，34（8）：714-718.

8 He A，Bai J，Huang C，et al.Detection of serum tumor markers in multiple myeloma using the CLINPROT system[J].International journal of hematology，2012，95：668-674.

9 房亞哲，劉津，吳琳，等.應(yīng)用尿液蛋白質(zhì)組技術(shù)篩選多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)蛋白的初步研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（4）：647-650.

10 王劍利，白菊，何愛(ài)麗，等.利用血清蛋白質(zhì)組差異分析多發(fā)性骨髓瘤的耐藥機(jī)制[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，33（3）：340-343.

11 鐘立業(yè)，劉天浩，李揚(yáng)秋，等.骨髓增生異常綜合征患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)特征研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（21）：3586-3588.

12 鐘立業(yè)，劉天浩，耿素霞，等.利用MALDI-TOF-MS分析RAEB型骨髓增生異常綜合征患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)特征[J].中華腫瘤防治雜志，2009，14（21）：1625-1628.

13 Hachani J，Duban-Deweer S，Pottiez G，et al.MALDI-TOF MS profiling as the first-tier screen for sickle cell disease in neonates：matching throughput to objectives[J].Proteomics Clinical applications，2011，5：405-414.