某地區(qū)不同食源性大腸桿菌耐藥性檢測分析

譚琳琳 孔軍

[摘要]目的：檢測分析某地區(qū)不同食源性大腸桿菌耐藥性。方法：2018年至2019年采集某地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場、各大超市肉品、蔬菜、乳制品、即食食品樣品396份，分離出大腸桿菌陽性樣品126份，陽性率為31.8%。結(jié)果：126株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酮酸的耐藥性較高，分別為44.4%、39.7%、38.1%。肉品、蔬菜分離株對四環(huán)素的耐藥性較高，分別為57.1%、52.9%;乳制品分離株對氨芐西林的耐藥性較高，為26.7%;即食食品分離株對各抗生素的耐藥性最低，為0。耐藥菌株中，sul2耐藥基因檢出率最高，addB耐藥基因檢出率最低，分別為75.0%、19.2%。結(jié)論：某地區(qū)食源性大腸桿菌具有較為嚴(yán)重的多重耐藥性。

[關(guān)鍵詞]食源性大腸桿菌;耐藥性;肉品;蔬菜;乳制品;即食食品

[中圖分類號]R155.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2096-5249（2021）23-0205-02

大腸桿菌屬于一種條件致病菌，是食品糞便與水源污染指示菌，也是人與動物腸道共生菌，周生菌毛與鞭毛，又稱革蘭氏陰性無芽孢桿菌，一些大腸桿菌能夠?qū)⒛c毒素產(chǎn)生，引發(fā)嬰兒與幼畜嚴(yán)重腹瀉[1]。本研究檢測分析了某地區(qū)不同食源性大腸桿菌耐藥性。

1材料與方法

1.1材料（1）菌株：2018年至2019年采集某地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場、各大超市肉品、蔬菜、乳制品、即食食品樣品396份，分離出大腸桿菌陽性樣品126份，陽性率為31.8%。（2）藥敏紙片和培養(yǎng)基：慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素等氨基糖苷類，四環(huán)素等四環(huán)素類，氯霉素等氯霉素類，環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酮酸等喹諾酮類，復(fù)方新諾明等磺胺類，氨芐西林、頭孢他啶、哌拉西林、頭孢噻肟、亞胺培南、阿莫西林等β-內(nèi)酰胺類，紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類，多粘菌素B等多粘菌素類;藥敏紙片：購買杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的抗生素藥敏紙片;培養(yǎng)基：購買青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的MH瓊脂培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、LST培養(yǎng)基。（3）儀器和設(shè)備：購買蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)的SW-CJ型凈化工作臺，上海弘芯電子科技有限公司生產(chǎn)的LabTech自動高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)的SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、HPX-9272MBE型電熱培養(yǎng)箱，上海領(lǐng)德儀器有限公司生產(chǎn)的BCD-268E型低溫冷藏箱，北京市六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-BC型電泳儀。

1.2方法

1.2.1菌株分離在225ml0.85%生理鹽水中放入25g樣品，均質(zhì)后用移液槍將1ml均質(zhì)液吸取出來，在LST肉湯管中放置，在37°C的溫度下培養(yǎng)2d，將產(chǎn)氣的LST管挑出來，將100μl菌液吸取出來，在EC肉湯管中放置，在44°C的溫度下培養(yǎng)2d。將菌液從產(chǎn)氣EC管中挑取出來，在37°C的溫度下劃線培養(yǎng)于EMB培養(yǎng)基中18～24h，將具有金屬光澤的單一菌落挑出來。

1.2.2生化試驗(yàn)與PCR檢測（1）生化試驗(yàn)：采用IMVIC試驗(yàn)生化鑒定大腸桿菌，包括枸櫞酸鹽試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)，大腸桿菌對其結(jié)果為-、+、-、-或-、+、-、+。（2）PCR檢測：將陽性對照菌株設(shè)定為石河子大學(xué)動物科學(xué)院微生物學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供的大腸桿菌ATCC25922，采用PCR技術(shù)對所挑選出的菌株攜帶uidA情況進(jìn)行檢測。uidA基因上游引物序列為5’-CGATTCCGTTTCAGGGTT-3’，下游引物序列為5’-TTTCTGATAGGACCGAGCAT-3’，擴(kuò)增片段為194bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：引物F、R、10×buffer、dNTP、Taq酶、去離子水、E.coliDNA模板分別1μl、1μl、2.5μl、2μl、0.5μl、17μl、1μl，共25μl。PCR擴(kuò)增條件：在94°C、94°C、60°C、72°C溫度下分別預(yù)變性、變性、退火、延伸10min、1min、1min、1min，35個(gè)循環(huán)，最后在72°C的溫度下延伸10min。

1.2.3藥敏試驗(yàn)用滅菌棉簽在整個(gè)平板鋪滿稀釋好的菌液，待平板干后，用無菌鑷子在平板上貼各種藥片，將3張藥片貼在每個(gè)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中放置貼好藥片的平板18～20h。將質(zhì)控菌株設(shè)置為大腸桿菌ATCC25922，藥敏試驗(yàn)過程中運(yùn)用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的K-B法。對試驗(yàn)均對某一抗菌藥物或抗生素敏感性及敏感程度進(jìn)行判定時(shí)依據(jù)抑菌環(huán)存在情況及環(huán)的大小，對大腸桿菌對抗菌藥物或抗生素的耐藥性進(jìn)行判定時(shí)依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4耐藥基因檢測PCR鑒定分離株的tetA、tetB、strA、strB、aadAla、aadB、blaTEM、floR、sul2等9種耐藥基因?；虮葘r(shí)依據(jù)GenBank及文獻(xiàn)上公布的序列，將9種耐藥基因相關(guān)引物設(shè)計(jì)出來。耐藥基因的PCR引物序列：tetA、tetB、strA、strB、aadA1a、aadB、blaTEM、floR、sul2的上游引物分別為5’-GCTACATCCTGCTTGCCTTC-3’、5’-TTGGTTAGGGGCAAGTTTTG-3’、5’-CCTGGTGATAACGGCAATTC-3’、5’-ATCGTCAAGGGATTGAAACC-3’、5’-AACGACCTTTTGGAAACTTCGG-3’、5’-GGGCGCGTCATGGAGGAGTT-3’、5’-TTGGGTGCACGACTGGGT-3’、5’-CACGTTGAGCCTCTATAT-3’、5’-GCGCTCAAGGCAGATGGCATT-3’，下游引物分別為5’-CATAGATCGCCGTGAAGAGG-3’、5’-GTAATGGGCCAATAACACCG-3’、5’-CCAATCGCAGATAGAAGGC-3’、5’-GGATCGTAGAACATATTGGC-3’、5’-TTCGCTCATCGCCAGCCCAG-3’、5’-TATCGCGACCTGAAAGCGGC-3’、5’-TAATTGTTGCCGGGAAGC-3’、5’-ATGCAGAAGTAGAACGCG-3’、5’-GCGTTTGATACCGGCACCCGT-3’，擴(kuò)增片段分別為210bp、659bp、546bp、509bp、352bp、329bp、503bp、868bp、285bp。

2結(jié)果

2.1不同來源大腸桿菌的耐藥性分析126株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酮酸的耐藥性較高，分別為44.4%、39.7%、38.1%。肉品、蔬菜分離株對四環(huán)素的耐藥性較高，分別為57.1%、52.9%;乳制品分離株對氨芐西林的耐藥性較高，為26.7%;即食食品分離株對各抗生素的耐藥性最低，為0。見表1。

2.2PCR檢測結(jié)果分析耐藥菌株中，sul2耐藥基因檢出率最高，addB耐藥基因檢出率最低，分別為75.0%、19.2%。見表2。

3討論

本研究結(jié)果表明，126株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酮酸的耐藥性較高，分別為44.4%、39.7%、38.1%。肉品、蔬菜分離株對四環(huán)素的耐藥性較高，分別為57.1%、52.9%;乳制品分離株對氨芐西林的耐藥性較高，為26.7%;即食食品分離株對各抗生素的耐藥性最低，為0。耐藥菌株中，sul2耐藥基因檢出率最高，addB耐藥基因檢出率最低，分別為75.0%、19.2%，說明大腸桿菌作為一種耐藥指示菌作用極好，研究食物中的大腸桿菌能夠?qū)κ称肺⑸镲L(fēng)險(xiǎn)評估進(jìn)行完善，從而對有害大腸桿菌數(shù)量進(jìn)行控制。將大腸桿菌的藥敏特性、流行病學(xué)數(shù)據(jù)收集起來，將食源性大腸桿菌溯源分析數(shù)據(jù)庫建立起來能夠?qū)⒖茖W(xué)依據(jù)提供給對耐藥性流行規(guī)律的了解、對耐藥性發(fā)展趨勢的預(yù)測[2]。

綜上所述，某地區(qū)食源性大腸桿菌具有較為嚴(yán)重的多重耐藥性，值得臨床充分重視。

參考文獻(xiàn)

[1]張?jiān)Ｏ椋?，梁靜，等.2017-2019年新疆烏魯木齊地區(qū)急性感染性腹瀉常見病原菌分布及其耐藥性分析[J].實(shí)用藥物與臨床，2020，23（7）：641-645.

[2]李穗霞，席美麗，王盼盼，等.8省市雞肉源性大腸桿菌分離鑒定及其耐藥性檢測[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2018，34（2）：158-164.