錯(cuò)配修復(fù)蛋白聯(lián)合p53蛋白檢測(cè)在肝細(xì)胞癌預(yù)后中的應(yīng)用

白茹夢(mèng)，江 悅，陶 燃，陳春妮，宋國(guó)新，張智弘

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是一類病死率高的腫瘤，亞洲患者中尤為常見[1]。流行病學(xué)研究已經(jīng)確定慢性乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染以及黃曲霉素B1的飲食暴露是該疾病最主要的致病因素[2-3]。雖然現(xiàn)階段改進(jìn)了診斷技術(shù)及治療方法，但有大腫瘤或多發(fā)腫瘤的患者預(yù)后仍較差[1,4]。基因組不穩(wěn)定包括兩類，染色體不穩(wěn)定(chromsome instability, CIN)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)[5]。微衛(wèi)星也稱為短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)，由長(zhǎng)度為1～6個(gè)堿基的重復(fù)序列組成[2,6]。MSI是由錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR)基因突變或其基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化引起的超突變表型[2-3]，在該過程中起關(guān)鍵作用的4種基因包括：MLH1、MSH2、MSH6和PMS2[7]，其編碼的蛋白可通過形成異二聚體，識(shí)別DNA復(fù)制過程中堿基對(duì)的錯(cuò)配和小核苷酸的插入或缺失突變[8]。TP53基因定位于染色體17p13.1上，編碼p53蛋白[1,9]。野生型p53是眾所周知的腫瘤抑制基因，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、周期、凋亡等和DNA損傷修復(fù)，p53突變可能導(dǎo)致包括肝癌在內(nèi)的50多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。

由于肝細(xì)胞癌的病因以及用于篩查MSI的技術(shù)變化較大，目前關(guān)于肝細(xì)胞癌中MSI的發(fā)生率仍存在一定差異，并且p53與肝細(xì)胞癌患者生存的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。本文采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)肝細(xì)胞癌中4種MMR及p53蛋白的表達(dá)，旨在探討其與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系及預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料收集2012年8月1日～2013年12月31日南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行外科手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌石蠟組織標(biāo)本220例，除外膽管細(xì)胞癌和混合型肝癌。收集患者臨床病理資料及隨訪包括患者年齡、性別、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、分化程度、纖維化程度、脈管內(nèi)癌栓、總生存期和無進(jìn)展生存期等，所有標(biāo)本均未行放、化療及針對(duì)腫瘤的其他治療。

1.2 組織芯片選擇具有代表性的肝細(xì)胞癌區(qū)域和正常組織區(qū)域進(jìn)行組織芯片制作，采用美國(guó)Beecher組織芯片陣列儀，蠟塊分成肝細(xì)胞癌塊和正常組織塊，直徑為1.0 mm的代表性組織取自福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)組織，并填充于空白蠟塊中。

1.3 免疫組化采用免疫組化EnVision兩步法，將組織芯片蠟塊4 μm厚切片后，烤片1～2 h，脫蠟水化。高壓下修復(fù)抗原，分別滴加MLH1(鼠單抗ES05)、MSH2(兔單抗RED2)、MSH6(兔單抗EP49)、PMS2(兔單抗EP51)、p53(鼠單抗MX008)一抗，在4 ℃冰箱中孵育過夜，用PBST洗滌3次后加入二抗，室溫下孵育17 min，PBST洗滌3次，DAB(即配即用)顯色3～5 min，經(jīng)蘇木精復(fù)染后分化、脫水、透明和封固。所用試劑均購(gòu)自福州邁新公司。

1.4 結(jié)果判讀免疫組化染色由兩名高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片。MMR陽性定義：細(xì)胞核不著色為表達(dá)缺失，超過1%的細(xì)胞核著色完整為陽性，4種MMR基因蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均表達(dá)者為錯(cuò)配修復(fù)基因完整(pMMR)，有一種及以上蛋白表達(dá)缺失者為錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷(dMMR)。p53免疫組化染色為細(xì)胞核陽性；p53突變型定義為腫瘤細(xì)胞中有彌漫強(qiáng)陽性核染色或所有腫瘤細(xì)胞中p53完全不表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)，單因素生存分析采用Kaplan-Meier分析、Log-rank檢驗(yàn)，Cox多因素回歸模型用于評(píng)估肝細(xì)胞癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征220例肝細(xì)胞癌組織中，男性178例，女性42例；患者年齡27～84歲，≤60歲者149例，>60歲者71例；腫瘤最大直徑為1.0～20.0 cm，其中≤3 cm者68例，>3 cm者152例；高+中度分化179例，低分化41例；纖維化程度分為肝纖維化68例，肝硬化152例；有脈管內(nèi)癌栓46例和無脈管內(nèi)癌栓174例；無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移83例，有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移83例，失訪54例；僅肝臟轉(zhuǎn)移56例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移22例，失訪5例；AFP水平≤400 ng/mL者129例，>400 ng/mL者85例，失訪6例；總生存時(shí)間為0～60.8個(gè)月，平均34.3個(gè)月，中位生存時(shí)間為40.1個(gè)月；無進(jìn)展生存時(shí)間為0～58.6個(gè)月，平均29.1個(gè)月。

2.2 肝細(xì)胞癌中MMR表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系腫瘤細(xì)胞中dMMR(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)發(fā)生率為64.9%(圖1)；其中腫瘤最大直徑≤3 cm者32例，>3 cm者99例，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)；高+中分化者115例，低分化者16例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)；復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移部位僅肝臟轉(zhuǎn)移者38例，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為8例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)；而與患者性別、年齡、纖維化程度、脈管內(nèi)癌栓、AFP水平及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移無關(guān)(表1)。

圖1 A.肝細(xì)胞癌中MLH1細(xì)胞核陽性，EnVision兩步法；B.肝細(xì)胞癌中MLH1細(xì)胞核陰性，EnVision兩步法；C.肝細(xì)胞癌中MSH2細(xì)胞核陽性，EnVision兩步法；D.肝細(xì)胞癌中MSH2細(xì)胞核陰性，EnVision兩步法；E.肝細(xì)胞癌中MSH6細(xì)胞核陽性，EnVision兩步法；F.肝細(xì)胞癌中MSH6細(xì)胞核陰性，EnVision兩步法；G.肝細(xì)胞癌中PMS2細(xì)胞核陽性；H.肝細(xì)胞癌中PMS2細(xì)胞核陰性，EnVision兩步法

2.3 肝細(xì)胞癌中p53表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系p53在癌旁組織中均為陰性，在腫瘤組織中突變率為72.4%(圖2)；其中高+中分化者為129例，低分化者為23例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)；無脈管內(nèi)癌栓者127例，有脈管內(nèi)癌栓者25例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)；AFP水平≤400 ng/mL者為98例，>400 ng/mL者為49例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)；而與患者性別、年齡、腫瘤大小、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移及其部位無關(guān)(表1)。

表1 肝細(xì)胞癌中MMR、p53與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 MMR、p53表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性MMR與p53突變之間無顯著相關(guān)性(表2)。Kaplan-Meier生存分析顯示，MMR與肝細(xì)胞癌患者的總生存期(P=0.507)和無進(jìn)展生存期(P=0.538)無相關(guān)性(圖3)；p53突變也與肝細(xì)胞癌患者的總生存期(P=0.220)和無進(jìn)展生存期(P=0.344)無相關(guān)性(圖4)。pMMR病例中，p53突變與肝細(xì)胞癌患者的總生存期(P=0.392，圖5A)和無進(jìn)展生存期(P=0.298，圖5B)之間無顯著相關(guān)性；而dMMR病例中，p53突變與肝細(xì)胞癌患者的總生存期(P=0.009，圖5C)和無進(jìn)展生存期(P=0.013，圖5D)之間有顯著相關(guān)性，即野生型p53伴MMR蛋白缺陷的患者預(yù)后較差。Cox單因素生存分析表明腫瘤最大徑、AFP水平、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及其部位是肝細(xì)胞癌預(yù)后較差的危險(xiǎn)因素(表3)。Cox多因素回歸分析表明肝細(xì)胞癌患者中伴有肝外轉(zhuǎn)移者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是僅有剩余肝臟轉(zhuǎn)移者的3.331倍(表4)。

圖3 MMR蛋白與肝細(xì)胞癌患者總生存期(A)和無進(jìn)展生存期(B)的Kaplan-Meier生存分析

圖4 p53與肝細(xì)胞癌患者總生存期(A)和無進(jìn)展生存期(B)的Kaplan-Meier生存分析

圖5 A.pMMR中p53與肝細(xì)胞癌患者總生存期的Kaplan-Meier生存分析；B.pMMR中p53與肝細(xì)胞癌患者無進(jìn)展生存期的Kaplan-Meier生存分析；C.dMMR中p53與肝細(xì)胞癌患者總生存期的Kaplan-Meier生存分析；D.dMMR中p53與肝細(xì)胞癌患者無進(jìn)展生存期的Kaplan-Meier生存分析

表2 MMR與p53表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

表3 Cox單因素生存分析

表4 Cox多因素生存分析

本組標(biāo)本220例，由于制片損耗MMR組有效例數(shù)為202例，p53組有效例數(shù)為210例，共同有效病例數(shù)為194例

3 討論

不同腫瘤類型中MSI頻率存在較大的差異，多數(shù)研究表明肝細(xì)胞癌中MSI的頻率為0～48%[2,4]。Han等[12]研究表明：MSI僅存在于15%散發(fā)性結(jié)直腸癌中，但依然是結(jié)直腸癌患者良好預(yù)后和免疫治療的可靠標(biāo)志物。MSI可有效預(yù)測(cè)右側(cè)結(jié)直腸癌患者的無進(jìn)展生存期，尤其是女性患者。Zhang等[3]研究表明：在1個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的56例肝細(xì)胞癌中有18例(32.1%)發(fā)現(xiàn)MSI，其中有10例(17.9%)伴高度MSI，且肝硬化組織中MSI的發(fā)生率(27%)幾乎是正常肝組織的3倍，肝細(xì)胞癌組織中MSI的發(fā)生率與肝硬化的發(fā)生率無明顯差異。Kazachkov等[13]研究發(fā)現(xiàn)MSI可能在10例患者中有4例起促進(jìn)肝癌發(fā)生的作用，且其與p53之間無相關(guān)性。本組通過免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)4種MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)和p53蛋白，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者中dMMR的發(fā)生率為64.9%(131/202)，p53蛋白突變率為72.4%(152/210)，兩者之間無相關(guān)性，與Kazachkov等[13]報(bào)道相符。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌中dMMR與患者腫瘤大小、分化程度及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移部位相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與患者性別、年齡、纖維化程度、脈管侵犯、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等無關(guān)?？赡苁怯捎贛MR蛋白在細(xì)胞中主要扮演DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的“監(jiān)督者”的角色，一旦細(xì)胞出現(xiàn)異常突變，MMR蛋白立即啟動(dòng)修復(fù)，dMMR往往與細(xì)胞生長(zhǎng)等指標(biāo)如腫瘤大小、分化程度和復(fù)發(fā)等顯著相關(guān)，而與患者年齡、性別和纖維化程度等差異無顯著性。

Nikolova等[14]報(bào)道p53突變與腫瘤患者局部復(fù)發(fā)、治療失敗以及許多類型腫瘤患者低生存率等相關(guān)。Yang等[10]則認(rèn)為雖然p53具有良好的抗腫瘤作用，但其在肝細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值較低。因此，p53表達(dá)不能用于預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者的生存率，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

Perez等[5]研究結(jié)果表明MMR在結(jié)直腸癌中未引起TP53突變，可能是由于其他生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因比TP53更容易在MMR缺乏的背景下產(chǎn)生突變，而這些其他基因的突變可能會(huì)降低TP53突變的概率。本組發(fā)現(xiàn)盡管單一MMR或p53與肝細(xì)胞癌患者的總生存期和無進(jìn)展生存期無相關(guān)性，但MMR缺陷患者中p53突變與肝細(xì)胞癌患者的總生存期和無進(jìn)展生存期有相關(guān)性(P=0.009、P=0.013)，即MMR蛋白缺陷且p53突變型患者具有較好的預(yù)后。Florijan等[15]報(bào)道腎腫瘤中攜帶功能性突變p53的患者預(yù)后較好，為預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后又提出一項(xiàng)可行的方案。相反MMR蛋白穩(wěn)定的患者中p53與總生存期和無進(jìn)展生存期無相關(guān)性(P=0.392、P=0.298)，可能是由于在MMR蛋白穩(wěn)定的狀態(tài)下可以修復(fù)DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄中的突變，保證基因組的穩(wěn)定性，同時(shí)也包括減少p53突變的概率。本組采用免疫組化EnVision兩步法代替PCR法檢測(cè)MSI，具有成本低、難度小的特點(diǎn)，但只能檢測(cè)到數(shù)量有限的MMR蛋白，由于所選病例不同、試劑敏感性差異、實(shí)驗(yàn)操作中的誤差以及免疫組化陽性尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，均會(huì)產(chǎn)生較多假陽性或假陰性結(jié)果。DNA測(cè)序可通過檢測(cè)DNA修復(fù)基因的突變來評(píng)估MSI狀態(tài)，被譽(yù)為檢測(cè)MSI的“金標(biāo)準(zhǔn)”；Yan等[16]通過對(duì)比免疫組化和DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，兩種檢測(cè)方法之間存在適度的一致性，聯(lián)合檢測(cè)或許會(huì)得到更為可靠的結(jié)果。

本組使用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)p53和4種MMR蛋白，結(jié)果表明dMMR與腫瘤大小、分化程度和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移部位相關(guān)，而p53突變與分化程度、脈管內(nèi)癌栓和AFP水平相關(guān)，且聯(lián)合MMR蛋白和p53檢測(cè)可以較好預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，即MMR蛋白缺陷且p53突變型患者的總生存期明顯高于其他患者，為臨床預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后又提出一項(xiàng)可行的方案。