生物鐘基因Bmal1與骨代謝相關(guān)性的研究進(jìn)展

余明芳 劉旭光 吳曉

1西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院（四川瀘州640000）；2瀘州市中醫(yī)醫(yī)院針灸科（四川瀘州646000）；3成都中醫(yī)藥大學(xué)（成都610037）

哺乳動物的許多生理過程，包括骨代謝，都受生物鐘的調(diào)節(jié)。調(diào)控晝夜節(jié)律的生物鐘由位于視交叉上核（SCN）的中樞鐘和各種外周鐘組成。晝夜節(jié)律產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)來源于生物鐘基因之間的協(xié)調(diào)表達(dá)。目前主要的生物鐘基因有：Clock、Bmal1、Pers、Crys、Rev-erbα、Ror 等。其中，Bmal1 是分子生物鐘的核心調(diào)節(jié)器，因為它有能力刺激晝夜節(jié)律中的多種基因的轉(zhuǎn)錄，提供穩(wěn)健的晝夜節(jié)律。

在骨骼中，已有文獻(xiàn)研究認(rèn)識到軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的代謝功能表現(xiàn)出內(nèi)在的晝夜節(jié)律［1］。各種骨代謝指標(biāo)和骨代謝調(diào)節(jié)激素顯示有晝夜節(jié)律性。晝夜節(jié)律的紊亂會破壞骨代謝的動態(tài)平衡。骨骼動態(tài)平衡是一個內(nèi)在的動態(tài)過程，其機(jī)制的復(fù)雜性不僅源于所涉分子的數(shù)量及其多方面的相互作用，還源于生物鐘控制。晝夜節(jié)律的紊亂與骨代謝疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥）之間存在密切聯(lián)系。據(jù)報道，在絕經(jīng)后婦女中，夜間睡眠不足有更大的骨質(zhì)流失風(fēng)險［2］。與白天工作的工人相比，輪班工人的骨密度更低，骨折風(fēng)險更高［3］。由此可見，晝夜節(jié)律在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，而生物鐘基因Bmal1 對于維持24 h 節(jié)律至關(guān)重要［4］。

1 核心生物鐘基因Bmal1

Bmal1（brain and muscle ARNT-like-1）基因，是生物鐘基因晝夜節(jié)律的重要元件，在細(xì)胞核內(nèi)驅(qū)動節(jié)律性的晝夜轉(zhuǎn)錄。晝夜節(jié)律由生物鐘基因之間形成的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)維持。

CLOCK 和BMAL1 的編碼蛋白構(gòu)成的異二聚體是反饋環(huán)中的中心節(jié)點(diǎn)和反饋回路的轉(zhuǎn)錄啟動子，它去激活轉(zhuǎn)錄靶基因啟動子區(qū)域的所有E-box順式元件，即PER、CRY 等。PER 和CRY 蛋白構(gòu)成的二聚體PER/CRY 反過來抑制CLOCK/BMAL 1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。隨后PER/CRY 的降解會釋放其對CLOCK/BMAL1 的抑制作用，開始新的轉(zhuǎn)錄翻譯循環(huán)。該環(huán)路通常被認(rèn)為是晝夜節(jié)律的經(jīng)典調(diào)控環(huán)路。另一個反饋環(huán)路中，通過CLOCK/BMAL1 異二聚體翻譯出的ROR 和REV-ERB 蛋白分別作為激活劑和抑制劑參與Bmal1 的調(diào)控［5］。

2 骨代謝的細(xì)胞分子調(diào)控特點(diǎn)

骨的細(xì)胞在不停地進(jìn)行細(xì)胞代謝，以維持骨的生長、發(fā)育及重建，即骨代謝。骨骼的發(fā)育和骨形態(tài)的終生維持涉及四種關(guān)鍵的細(xì)胞類型，包括軟骨、成骨、破骨細(xì)胞及骨細(xì)胞，其中軟骨、成骨、破骨細(xì)胞與Bmal1 密切相關(guān)。軟骨細(xì)胞是發(fā)育過程中出現(xiàn)的第一種細(xì)胞類型，在早期胚胎發(fā)育中，間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，增殖并分泌含有彈性蛋白和Ⅱ型膠原的基質(zhì)，形成軟骨類似物。成骨細(xì)胞來源于多能間充質(zhì)干細(xì)胞，主要功能是產(chǎn)生骨細(xì)胞外基質(zhì)的有機(jī)成分，促進(jìn)無機(jī)成分的礦化。破骨細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞的單核-巨噬細(xì)胞前體分支，其負(fù)責(zé)骨吸收，對骨骼的正常發(fā)育、終生保持其完整性和鈣代謝起著重要作用［6］。骨代謝需要骨骼系統(tǒng)不斷的吸收和重建以維持體內(nèi)平衡，骨重建由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞組成，多種激素、細(xì)胞因子和生長因子在骨重建中起重要作用［7］。一旦平衡破壞，就可能發(fā)生各種骨代謝疾病，如骨發(fā)育不全、骨質(zhì)硬化癥以及骨關(guān)節(jié)炎等［8］。

3 Bmal1 通過調(diào)節(jié)軟骨、成骨及破骨細(xì)胞影響骨代謝

3.1 軟骨細(xì)胞Bmal1 指導(dǎo)許多涉及軟骨穩(wěn)態(tài)基因的晝夜節(jié)律表達(dá)，包括參與分解、合成和細(xì)胞凋亡途徑的基因。軟骨細(xì)胞內(nèi)源性生物鐘紊亂可能是骨關(guān)節(jié)炎早期病變的關(guān)鍵步驟?；罨疶 細(xì)胞核因子（NFAT）是骨關(guān)節(jié)炎（OA）的關(guān)鍵抑制因子。研究表明敲除Bmal1 會下調(diào)NFATC2 的水平，并下調(diào)主要軟骨基質(zhì)相關(guān)基因Sox9，Acan 和Col2a1 的表達(dá)［9］。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NAD+）和沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）是人類膝關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞代謝基因，在OA 軟骨中，NAD+的水平顯著下調(diào)，導(dǎo)致煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶活性和Sirt1 表達(dá)受到抑制。Bmal1 的敲除會降低IL-1β刺激下的NAD+水平，上調(diào)OA 相關(guān)基因的表達(dá)，Bmal1 的過表達(dá)則緩解了IL-1β引起的改變［10］。TGF-β信號傳導(dǎo)對于維持軟骨的代謝和結(jié)構(gòu)完整至關(guān)重要，它有利于軟骨細(xì)胞分化和軟骨修復(fù)，其失調(diào)會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞合成代謝的活性降低，觸發(fā)骨關(guān)節(jié)炎［11］，干擾軟骨細(xì)胞中Bmal1 的晝夜節(jié)律會影響TGF-β信號傳導(dǎo)［12］。

軟骨細(xì)胞中Bmal1 基因缺陷會導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨節(jié)律失常，對關(guān)節(jié)發(fā)育產(chǎn)生不利影響。研究［13］證實，小鼠軟骨細(xì)胞中Bmal1 的靶向敲除會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退化，從3 個月大時開始，軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)就會明顯丟失。Bmal1 敲除會顯著抑制軟骨細(xì)胞增殖并激活細(xì)胞凋亡的生長板。有實驗觀察到Bmal1 敲除小鼠在青春期表現(xiàn)出生長遲緩，整個生長板的長度和增殖區(qū)都比對照組短。敲除Bmal1 會抑制生長板軟骨細(xì)胞中VEGF和HIF1α的表達(dá)，增強(qiáng)MMP13 和Runx2 的表達(dá)水平。與體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)一致，Bmal1 的敲除可能導(dǎo)致軟骨細(xì)胞增殖減少，HIF1α和VEGF 的表達(dá)下調(diào)以及培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞凋亡增加［14］。Runx2 是促成骨細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，對軟骨細(xì)胞成熟至關(guān)重要。非自然明相條件下飼養(yǎng)的Bmal1 敲除小鼠，其SCN 中Runx2 mRNA 無法檢測，這表明Runx2 依賴生物鐘基因Bmal1 的調(diào)控［15］。

3.2 成骨細(xì)胞Bmal1 在糖尿病性骨代謝疾病中具有潛在修復(fù)作用。在糖尿病骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中β-catenin 和T 細(xì)胞因子的表達(dá)下調(diào)，而糖原合酶激酶3β（GSK-3β）和nemo-like激酶（NLK）的表達(dá)上調(diào)。過表達(dá)的Bmal1可以通過下調(diào)GSK-3β的表達(dá)來激活Wnt/β-catenin 通路，部分恢復(fù)糖尿病中BMSCs 的成骨作用［16］。Bmal1 可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞MC3T3-E1 中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）的表達(dá)來誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。研究表明，Bmal1 的過表達(dá)增加了成骨基因的表達(dá)，包括DNA 結(jié)合抑制劑、Runx2 和骨鈣蛋白，這些因子是BMP2 重要的下游因子。實驗證實Bmal1 敲除細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的BMP2 表達(dá)下調(diào)［17］。

Bmal1 缺乏可引起骨量減少、骨量表型降低。Wnt 通路有促成骨分化功能，其核心因子β-catenin在衰老小鼠中表現(xiàn)出下調(diào)的表達(dá)。研究報道Bmal1 敲除小鼠表現(xiàn)出許多早衰的特征，例如骨量減少。有實驗用慢病毒載體在NIH-3T3 細(xì)胞中介導(dǎo)Bmal1 過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Bmal1 過表達(dá)后，β-catenin在NIH-3T3 細(xì)胞中表達(dá)增加［18］。共培養(yǎng)實驗表明，Bmal1 的整體敲除導(dǎo)致骨量下調(diào)、骨吸收增加。小鼠中缺乏晝夜節(jié)律基因Bmal1 會導(dǎo)致骨量表型降低。有報道Bmal1 敲除小鼠的骨質(zhì)表型低，使用計算機(jī)斷層掃描顯示Bmal1 敲除小鼠的骨皮質(zhì)和骨小梁體積以及其他微結(jié)構(gòu)參數(shù)減少，且骨的礦物質(zhì)密度下調(diào)。組織學(xué)顯示Bmal1 敲除會誘導(dǎo)活性成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞數(shù)量減少。從Bmal1 敲除小鼠中分離出的BMSCs 表現(xiàn)出體外分化為成骨細(xì)胞的能力下調(diào)［19］。

3.3 破骨細(xì)胞Bmal1 可通過與破骨細(xì)胞相關(guān)基因的相互作用來影響骨量。外周破骨細(xì)胞生物鐘有助于驅(qū)動破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，如組織蛋白酶K（CTSK）和NFATc1。NFATc1 是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞終末分化的主開關(guān)，組織蛋白酶K 是破骨細(xì)胞活動增強(qiáng)的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)與Bmal1 蛋白相互作用的E-box 元件分別結(jié)合在CTSK613/NFATC1 啟動子、_613/NFATC1 607 和_5295/NFATC1 啟動子上，并且Bmal1 跟這些啟動子的結(jié)合與這些基因在不同時間點(diǎn)的RNA 變異是一致的。這意味著破骨細(xì)胞相關(guān)基因的振蕩受生物鐘基因Bmal1 的調(diào)節(jié)。染色質(zhì)免疫沉淀顯示Bmal1蛋白與CTSK和NFATc1啟動子區(qū)域存在相互作用，Bmal1 的表達(dá)上調(diào)會增強(qiáng)CTSK 和NFATc1 的表達(dá)［20］。2016年美國骨與礦物質(zhì)研究學(xué)會的一項數(shù)據(jù)表明，破骨細(xì)胞通過Bmal1 與SRC（類固醇受體共激活子）家族的相互作用以及與Nfatc1 啟動子的結(jié)合來調(diào)節(jié)骨吸收［21］。研究者在破骨細(xì)胞中特異性地敲除Bmal1，敲除小鼠由于破骨細(xì)胞分化減少而顯示出高骨量表型。

破骨細(xì)胞中Bmal1 被抑制可導(dǎo)致骨量減少。RANKL 是破骨細(xì)胞分化成熟的重要因子，RANKL信號通路對單核-巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞的終末分化至關(guān)重要。成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的OPG 是抑制破骨細(xì)胞分化和活性的細(xì)胞因子。但最終決定破骨細(xì)胞分化和活性的是RANKL 與OPG的比值。在BMSCs 中，2 型糖尿病引起代謝和功能紊亂，導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡，造成骨丟失。研究顯示糖尿病BMSC 中Bmal1 被抑制，RANKL/OPG 比值升高，促進(jìn)骨吸收。而Bmal1 過表達(dá)可增強(qiáng)BMSCs的成骨能力并抑制其破骨能力，從而改善了骨代謝［22］。

Bmal1缺乏可導(dǎo)致骨發(fā)育不全。RNA測序和蛋白質(zhì)芯片分析表明，MMP3 是Bmal1 的潛在靶標(biāo)，在晝夜節(jié)律紊亂或Bmal1 敲除小鼠中觀察到下頜發(fā)育不全（SMH），在SMH 青少年患者中，MMP3 明顯增加；在Bmal1 敲除小鼠3 ～10 周生長期間，MMP3 上調(diào)［23］。SMH 患者還存在Bmal1 和OPG 的表達(dá)下調(diào)，下頜骨骨量和骨體積減少，研究結(jié)果提示Bmal1 直接與Opg 啟動子結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞分化；體外外源補(bǔ)充OPG 顯著逆轉(zhuǎn)了由Bmal1 敲低引起的破骨細(xì)胞分化增強(qiáng)，通過腹膜內(nèi)注射OPG 可部分逆轉(zhuǎn)Bmal1 基因敲除引起的骨質(zhì)流失［24］。

4 異常的骨代謝擾亂Bmal1 的表達(dá)

在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中Bmal1 的表達(dá)逐漸降低，與正常軟骨相比，OA 中Bmal1 的mRNA 和蛋白水平都顯著下調(diào)。有研究［25］用IL-1β、過氧化氫或堿性磷酸鈣晶體處理軟骨細(xì)胞，結(jié)果與未處理的細(xì)胞相比，Bmal1 的峰值水平較低。N-甲基D-天冬氨酸受體亞單位（NMDAR）表達(dá)的改變會導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的晝夜節(jié)律和細(xì)胞表型改變。在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，NMDAR 抑制使PER2 和Bmal1 表達(dá)恢復(fù)到與正常軟骨細(xì)胞相似的水平，并調(diào)控MMP13 和COL10A1 下調(diào)［26］。除此以外，在骨關(guān)節(jié)炎中，正常分化軟骨細(xì)胞的表型喪失是導(dǎo)致疾病的原因之一。有研究調(diào)查了生物鐘基因在正常軟骨細(xì)胞與骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)是否有所不同，并使用RNAi 來確定觀察到的差異是否會影響軟骨細(xì)胞表型。研究［27］結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中Bmal1 的表達(dá)明顯較低。

TNF-α是RA 的關(guān)鍵靶標(biāo)，RA 患者的血清及滑膜中TNF-α顯著上調(diào)。TNF-α在體外和體內(nèi)都會誘導(dǎo)多個生物鐘基因的表達(dá)，并伴有晝夜節(jié)律波動。研究發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)的RA 滑膜細(xì)胞中TNF-α可誘導(dǎo)Bmal1 過表達(dá)［28］。有研究對照分析RA 和OA患者滑膜中13 個生物鐘基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在核心生物鐘基因中，Bmal1的表達(dá)在一天中變化最大。

褪黑素對于骨重建過程有重要作用，可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨成熟，并通過下調(diào)NF-κB 途徑來抑制破骨細(xì)胞的分化。BMP-4是調(diào)控骨發(fā)育的關(guān)鍵信號分子。研究表明褪黑素、BMP-4 促使Bmal1表達(dá)顯著上調(diào)，褪黑素對蛋白酶的抑制作用可以穩(wěn)定SCN 中Bmal1 蛋白的表達(dá)，特別是在褪黑素水平正常升高的夜間。

5 總結(jié)與展望

Bmal1 基因多方面的參與骨代謝的生理、病理功能，但是相關(guān)機(jī)制復(fù)雜多變，有待進(jìn)一步闡明。迄今為止，仍缺乏對不同類型的軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等和單個生物鐘基因的詳細(xì)研究。了解軟骨和骨骼中穩(wěn)態(tài)和代謝的晝夜節(jié)律為治療骨代謝疾病提供了一條新途徑。在小鼠軟骨中，大多數(shù)分解代謝基因的表達(dá)在清晨達(dá)到峰值，合成代謝基因的表達(dá)在深夜達(dá)到峰值［29］。因此，針對這些途徑的藥物應(yīng)在其靶標(biāo)最活躍的時刻使用，以在達(dá)到最大功效的同時將副作用降至最低。有研究用REV-ERB 激動劑SR9009 激活REVERB（Bmal1 轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)劑）使Bmal1 表達(dá)下調(diào)，結(jié)果顯示與OA 相關(guān)的痛覺過敏明顯減少。通過敲除背根神經(jīng)節(jié)（DRG）感覺神經(jīng)元中的Bmal1 紊亂分子生物鐘，可以減輕OA 模型的疼痛［30］。小分子調(diào)節(jié)劑可調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律時間并恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，其治療潛力值得開發(fā)。另外，采用“時間療法”的概念，可針對患者的晝夜節(jié)律量身定制藥物或治療方案，以最大程度地提高治療效果并減少不良反應(yīng)。今后將根據(jù)Bmal1 的分子機(jī)制研究出更多骨代謝相關(guān)疾病的干預(yù)措施。