八氫番茄紅素脫氫酶抑制劑類(lèi)除草劑的研究進(jìn)展

孫林靜 王 輝 張融雪 蘇京平 王勝軍 佟 卉 劉燕清 陳志材 李曉瑩 孫 玥*

(1.天津市農(nóng)作物研究所, 天津 300384; 2.南開(kāi)大學(xué), 天津 300073)

八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene Desaturase，PDS)是植物體內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶，在質(zhì)體內(nèi)參與以異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)為前體生成類(lèi)胡蘿卜素的過(guò)程。由于PDS在光合系統(tǒng)中具有非常重要的作用，因此以PDS為靶點(diǎn)的除草劑被迅速研制出來(lái)并得到推廣，例如氟啶酮、達(dá)草滅和氟咯草酮等[1]。

1 PDS作用通路及定位

1.1 PDS作用通路

八氫番茄紅素脫氫酶在類(lèi)胡蘿卜素生物合成中起著非常重要的作用，類(lèi)胡蘿卜素的生物合成需要兩個(gè)重要前體物質(zhì)—異戊二烯焦磷酸(Isopenteny diphosphate, IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate, DMAPP)。通常情況下，在高等植物中，IPP是通過(guò)甲基赤蘚糖醇(Methyl erythritol phosphate, MEP)途徑形成的[2]，即以3-磷酸甘油醛(GA-3-P)和丙酮酸(Pyruvate)為前體物質(zhì)經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)生成IPP。

如圖1所示，IPP在IPP異構(gòu)酶(Isopentenyl diphosphate isomerase，IPPI)的作用下異構(gòu)化生成DMAPP，然后DMAPP在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase, GGPS)的催化下與3分子的IPP縮合形成含有C20的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate, GGPP)[3]。兩分子的GGPP由八氫番茄紅素合成酶 (Phytoene synthase, PSY) 催化形成八氫番茄紅素(Phytoene)，再由八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene desaturase，PDS)催化八氫番茄紅素去飽和生成9,9’-二順式-ζ-胡蘿卜素(圖2)。接著在ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ζ-carotene isomerase, ZDS)催化下繼續(xù)脫氫，生成7,9,7’,9’-四順式-番茄紅素，經(jīng)類(lèi)胡蘿卜素異構(gòu)酶(Carotenoid isomersase，CRTISO)催化后得到全反式番茄紅素(Lycopene)，得到第一個(gè)有顏色、具最高數(shù)目共軛雙鍵的植物類(lèi)胡蘿卜素[4]，最后再經(jīng)過(guò)一系列環(huán)化反應(yīng)形成各種類(lèi)胡蘿卜素。

圖1 植物類(lèi)胡蘿卜素生物合成圖[5]

圖2 PDS催化反應(yīng)[6]

1.2 PDS的定位

Grunewald[7]研究發(fā)現(xiàn)，PDS基因在植物基因組中是以單拷貝的形式存在的，由其編碼的八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)定位于植物葉綠體的類(lèi)囊體上，與類(lèi)囊體膜相連。由于類(lèi)胡蘿卜素的生物合成是在細(xì)胞質(zhì)中完成的，所以類(lèi)胡蘿卜素合成所需的PDS首先要進(jìn)入細(xì)胞器[8]，然后再轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中才能發(fā)揮酶活[9]作用，而PDS的活性高低則取決于其與質(zhì)膜的結(jié)合程度[10]。

2 八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)抑制劑

PDS抑制劑類(lèi)除草劑的作用機(jī)理是抑制八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene Desaturase，PDS)在植物類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中的催化作用，從而抑制類(lèi)胡蘿卜素的生物合成達(dá)到抑制植物光合作用的目的，使植株停止生長(zhǎng)直至死亡。因此PDS抑制劑類(lèi)除草劑屬于類(lèi)胡蘿卜素生物合成抑制劑，經(jīng)此類(lèi)抑制劑處理后的植株最為明顯的表現(xiàn)是產(chǎn)生白化癥狀[11]。目前世界上進(jìn)入商品化開(kāi)發(fā)應(yīng)用的以PDS為作用靶標(biāo)的除草劑，主要品種有：噠嗪酮類(lèi)、氟草敏(Norflurazon)；酰胺類(lèi)、氟丁酰草胺(Beflubutamid)、氟吡酰草胺(Picolinafen)和吡氟酰草胺(Diflufenican)；吡啶類(lèi)、氟啶草酮(Fluridone)；吡咯烷酮類(lèi)、氟咯草酮(Flurochloridone)；苯基呋喃酮類(lèi)、呋草酮(Flurtamone)[12]。其中以氟草敏的使用最為廣泛，效果也最好。

氟草敏(Norflurazon)，CAS登記號(hào)為27314-13-2，中文別名噠草伏、達(dá)草滅，是由山德士公司開(kāi)發(fā)的噠嗪酮類(lèi)選擇性除草劑[13]，被登記用于喬性果樹(shù)、柑橘、棉花、堅(jiān)果作物、大豆和蔓越橘[14]。其性狀為無(wú)色結(jié)晶，熔點(diǎn)為175～178 ℃，25 ℃時(shí)在水中的溶解度為40 mg/L，易溶于乙醇、丙酮，難溶于烴類(lèi)，無(wú)腐蝕性。由圖2可知，PDS催化八氫番茄紅素脫氫反應(yīng)除了需要底物外，還需要NADPH、泛醌、FAD、ATP以及部分金屬離子[15]。而氟草敏與PDS所必需的輔酶因子泛醌(PQ)競(jìng)爭(zhēng)在PDS上的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制PDS催化八氫番茄紅素脫氫形成ζ-胡蘿卜素。

氟吡酰草胺主要用于冬小麥田苗前封閉防除婆婆納、繁縷、牛繁縷、寶蓋草、薺菜和播娘蒿等一年生闊葉雜草，在低溫和寒流及霜凍來(lái)臨前后不宜用藥，以防藥害。吡氟酰草胺用于小麥、大蒜播后苗前土壤噴霧，是播后苗前處理劑，當(dāng)雜草萌發(fā)通過(guò)藥土層時(shí)，幼芽或根系吸收了藥劑從而抑制雜草。氟啶草酮為棉花田專(zhuān)用除草劑，僅限棉田苗前土壤封閉使用，其他作物嚴(yán)禁使用。

3 PDS基因產(chǎn)生抗性的氨基酸位點(diǎn)

近些年來(lái)，陸續(xù)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些植物可對(duì)PDS抑制劑產(chǎn)生抗性，深入研究后發(fā)現(xiàn)這與PDS基因上的氨基酸位點(diǎn)產(chǎn)生突變有關(guān)。2004年，Michel 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黑藻PDS基因304位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻z氨酸、半胱氨酸或組氨酸后，黑藻被賦予氟啶草酮(Fluridone)抗性。2006年，Arias[9]等對(duì)黑藻PDS基因304位精氨酸進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)當(dāng)304位的氨基酸由精氨酸突變?yōu)樘K氨酸、半胱氨酸、丙氨酸及谷氨酰胺后，黑藻被賦予氟啶草酮(Fluridone)和達(dá)草滅(Norflurazon)抗性。2006年，Steinbrenner等[17]對(duì)雨生紅球藻PDS基因進(jìn)行修飾定向誘變，將504位的亮氨酸密碼子改為精氨酸密碼子，從而使雨生紅球藻對(duì)達(dá)草滅(Norflurazon)的抗性提高了43倍。2008年，Huang等[18]發(fā)現(xiàn)在小球藻PDS基因第516位氨基酸上由精氨酸取代亮氨酸后，小球藻對(duì)達(dá)草滅(Norflurazon)的抗性提高了36倍。2010年，Liu等[19]發(fā)現(xiàn)小球藻PDS基因516氨基酸位點(diǎn)處發(fā)生突變：苯丙氨酸取代了亮氨酸，該突變導(dǎo)致小球藻對(duì)達(dá)草滅(Norflurazon)的抗性提高了31倍。2013年，Liu等[20]在萊茵衣藻PDS基因的505位氨基酸位點(diǎn)上以苯丙氨酸取代亮氨酸，得到的萊茵衣藻對(duì)達(dá)草滅(Norflurazon)的抗性提高了27.7倍。2014年，Suarez等[21]研究發(fā)現(xiàn)在綠色萊茵衣藻(The green alga Chlamydomonas reinhardtii)的PDS基因的第131位氨基酸上的苯丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸后，突變后的萊茵衣藻被賦予達(dá)草滅(Norflurazon)抗性以及弱的氟啶草酮(Fluridone)、呋草酮(Flurtamone)抗性。見(jiàn)表1。

表1 PDS抑制劑類(lèi)除草劑抗性植物突變位點(diǎn)

4 結(jié)語(yǔ)

農(nóng)田雜草一直是困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展、阻礙農(nóng)作物產(chǎn)量提高的主要因素。在我國(guó)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成危害的農(nóng)田雜草有1400余種，其中嚴(yán)重危害的有130余種[22]，每年造成糧食產(chǎn)量損失10%左右[23]。隨著農(nóng)村種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整、耕作制度的改變，單一類(lèi)型除草劑的長(zhǎng)期使用，農(nóng)田雜草的種群變化和群落演替加速，除一些次要雜草逐漸成為主要雜草外，一些多年生雜草在農(nóng)田的發(fā)生危害也日趨嚴(yán)重。作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要糧食作物之一的水稻，日益嚴(yán)重的雜草稻危害使得培育出新型的、具有除草劑抗性的水稻品種迫在眉睫。而縱觀除草劑市場(chǎng)，以達(dá)草滅為代表的廣譜、高效、低毒、低殘留，減少公害且環(huán)境友好的白化除草劑，最為適合抗除草劑水稻品種的研究。對(duì)于具有除草劑抗性株系的種植，直接噴灑除草劑，再結(jié)合深耕、輪作等傳統(tǒng)種植方式，就能有效滅除雜草，成本低、施用簡(jiǎn)單、環(huán)境友好和低毒性的除草劑，具有廣闊的前景。本課題組正在開(kāi)展PDS靶標(biāo)關(guān)鍵位點(diǎn)突變的抗性研究，期望能創(chuàng)制出新的抗性水稻。