超聲波輔助水酶法提取米胚油及其成分分析

吳 非，李 釗，周 琪，劉春華，潘明喆,*，于殿宇,*，姚 凱

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.湖北天星糧油股份有限公司，湖北 隨州 441300）

水稻是世界上最重要的谷物作物之一，它是全球一半以上人口的主食。在稻谷中稻米胚芽含量約2.5%[1]，米糠含量約5.5%。稻米胚芽的相對密度及大小與米糠相近，在碾米時經(jīng)常和米糠混在一起，即通常所說的商業(yè)米糠實質(zhì)上是米糠和稻米胚芽之和，因此稻谷加工的出糠率約7%。近年來，有許多學(xué)者已經(jīng)研究了米糠的特性，發(fā)現(xiàn)了較高的營養(yǎng)價值。在研究中發(fā)現(xiàn)在谷類胚芽中也含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如玉米胚芽[2]、小麥胚芽[3]中均富含豐富的油脂、蛋白質(zhì)、生育酚等物質(zhì)，且胚芽中的油脂含量明顯高于麩皮中的油脂含量，具有很高的營養(yǎng)價值。稻米胚芽是稻谷籽粒的主要組成部分，其營養(yǎng)成分豐富，蛋白質(zhì)、脂類均在20%以上，還含有多種維生素和人體必需的微量元素[4-5]，總營養(yǎng)成分占整粒米的一半之多，被稱為“天賜營養(yǎng)源”。米胚的分離提取技術(shù)在日本較為發(fā)達[6]。但近年來國內(nèi)也有所發(fā)展，國內(nèi)研制的大米胚芽分離機采用風(fēng)選和振動篩相結(jié)合的方法可高效的提取米胚芽。陳延強等[7]參考相關(guān)資料采用振動分級和風(fēng)力風(fēng)選結(jié)合的技術(shù)工藝，從原料糠粞中提取出了粒狀米胚芽。米胚蛋白中的氨基酸組成較為平衡，可與大豆蛋白相媲美[8]且由于低過敏性和高谷胱甘肽含量非常適合生產(chǎn)嬰幼兒和特殊人群的食品[9]。而米胚油是在稻米胚芽中提煉出來的一種優(yōu)質(zhì)油脂，含有豐富的亞油酸和油酸[10]，在降低血清膽固醇，主要是低密度脂蛋白膽固醇方面非常有效[11]，其營養(yǎng)物質(zhì)也能促進皮膚微血管循環(huán)[12]，因此，研究米胚油的提取工藝具有十分重要的意義。

目前，植物油提取主要是溶劑浸提法[13]及壓榨法[14]， 浸提法用有機溶劑對油相進行萃取，提油率較高，但有機溶劑無法完全去除[15]。壓榨法殘油率高、蛋白質(zhì)在榨油過程中變性嚴(yán)重。水酶法是一種新興的植物油脂和蛋白質(zhì)提取技術(shù)[16]，水酶法提油是采用對植物原料細胞壁和脂蛋白、脂多糖等用酶處理，使油脂從油料中游離出來，而蛋白質(zhì)水解為小分子肽的提取技術(shù)。酶作用能夠破壞細胞壁，降低乳狀液的穩(wěn)定性，達到提高出油率的目的。該技術(shù)除有利于油脂提取的作用外，還具有保護油脂、蛋白質(zhì)、膠質(zhì)等成分品質(zhì)的作用[17]。水酶法工藝中分離出了油相，而乳狀液中保留了油料中特有的蛋白肽等水解物質(zhì)，經(jīng)過分離濃縮等技術(shù)可以被綜合利用成為植物蛋白飲料或低脂蛋白粉[18]。 此種方法提取油脂生產(chǎn)條件溫和[19]，符合綠色可持續(xù)發(fā)展的要求，且避免了對油脂和蛋白質(zhì)的嚴(yán)重 破壞[20]。因此受到了越來越多研究者的關(guān)注。

盡管通過酶引起的細胞壁降解可改善通過膜的油滲透性，但通過水酶法提取油脂方法依然比常規(guī)方法提取效率低，但如果在水酶法中運用超聲波輔助處理，則可進一步提高滲透性。超聲波處理法提取油脂的工藝主要是利用超聲波所具有的空化作用，是傳統(tǒng)提取方法的很好輔助。尤其是當(dāng)空化氣泡在植物材料表面塌陷時產(chǎn)生的沖擊波和剪切力會觸發(fā)植物細胞原的破壞，并促進目標(biāo)化合物擴散到溶劑中[21]。除此之外，還可利用超聲波具有的熱效應(yīng)、乳化、擴散、擊碎等許多次級效應(yīng)，加速稻米胚油和蛋白質(zhì)成分在溶劑中擴散、釋放，提高獲得效率。

本實驗運用纖維素酶和中性蛋白酶，通過纖維素酶酶解米胚芽的細胞壁，再通過中性蛋白酶降低細胞中脂質(zhì)與蛋白結(jié)合力進行水酶法提油，探究酶解條件對于水酶法提油的影響。然后，在水酶法的基礎(chǔ)上研究超聲輔助對于水酶法提油的影響，探究超聲時間、超聲功率等超聲因素對米胚油提取率的影響，并對超聲輔助提油工藝條件進行優(yōu)化，期望得到無溶劑并且富含生育酚、植物甾醇等生物活性成分的米胚油，同時為今后開發(fā)乳狀液中的米胚蛋白肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠 湖北天星糧油股份有限公司；中性蛋白酶（Neutrase 0.8L，酶活力為0.8 AU/g）、纖維素酶（700 EGU/g） 丹麥諾維信公司；本實驗所用試劑除甲酯化試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MPFX42大米胚芽分離機 浙江省糧食科學(xué)研究所；FA2004B電子天平、T6新世紀(jì)紫外分光光度計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；LP-XP150型超聲細胞破碎儀 無錫萊浦儀器設(shè)備有限公司；pHS3C型酸度計 上海雷磁儀器廠；5430臺式多功能高速離心機 上海盛析儀器設(shè)備有限公司；DF-101SA集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海耀特儀器設(shè)備有限公司；7890A氣相色譜儀、LC-100PHP高效液相色譜儀、LC-MS1000液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、6800氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國 安捷倫公司；H-7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助水酶法提取米胚油工藝

將一定量的原料米糠放入大米胚芽分離機中分離出稻米胚芽，首先對該批次的稻米胚芽粗脂肪進行檢測，發(fā)現(xiàn)其含油量為（25.93±0.03）%。再稱取25 g粉碎的稻米胚芽，米胚芽按不同的料液比加入到pH 7.0的緩沖溶液中調(diào)制[22]。設(shè)置液面浸沒變幅桿為3 cm，并將制備好的料液放置在超聲細胞破碎儀中按照相應(yīng)條件處理一段時間，同時為了避免樣品在超聲過程中溫度升高，在盛裝樣品容器外加冷水浴且超聲的工作時間和休息時間分別設(shè)置為4 s和10 s[23]。超聲完成后，在55 ℃條件下，加入復(fù)合酶（纖維素酶和中性蛋白酶質(zhì)量比為1∶1）酶解一段時間[24]，然后，90 ℃加熱10 min滅酶。冷卻至室溫后在10 000×g條件下離心15 min，得到游離油a、乳狀液、水解液和廢渣。移取上層清油并在105 ℃烘箱中干燥60 min進行脫水處理后稱得游離油a的質(zhì)量。將乳狀液在-20 ℃條件下冷凍過夜后，在室溫下解凍，將解凍后的乳狀液在4 000×g條件下離心15 min，移取上層清油，并對上層清油在烘箱中脫水干燥，稱得游離油b質(zhì)量，按下式計算提取率：

1.3.2 單因素試驗

按照1.3.1節(jié)超聲波輔助水酶法，設(shè)置單因素試驗考察超聲波對米胚油提取率的影響，單因素水平如下：加酶量（以米胚質(zhì)量計算，下同）0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、 1∶7（g/mL），酶解時間1、2、3、4、5 h，超聲功率100、200、300、400、500 W，超聲時間5、10、15、20、25 min，超聲溫度25、35、45、55、65 ℃，每個單因素試驗平行重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化米胚油提取工藝

在超聲輔助單因素試驗的基礎(chǔ)上，綜合考慮經(jīng)濟效益及胚芽油品質(zhì)，確定超聲各因素的最佳水平值范圍，采用響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計，研究各超聲參數(shù)對考察指標(biāo)的影響規(guī)律，并得到最佳提取條件。超聲時間（A）、超聲功率（B）、超聲溫度（C）為自變量，以米胚油提取率為響應(yīng)值，其因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.4 超聲處理效果

根據(jù)Anju等[25]的方法通過將10 μL的樣品懸浮液放置在碳涂層的銅網(wǎng)上滴鑄樣品。在成像之前，將滴鑄的格柵風(fēng)干。采用高對比度成像模式的透射電子顯微鏡分析在100 kV加速電壓下的尺寸和結(jié)構(gòu)測量。通過透射電鏡研究超聲波處理后米胚芽的特性，同時對比觀察未進行超聲處理的粉碎米胚芽的結(jié)構(gòu)特性。

1.3.5 脂肪酸組成分析

根據(jù)Nehdi等[26]的方法，通過向40 mg油中添加1 mL正己烷，再向其中加入200 μL 2 mol/L甲醇鈉 溶液，將油轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯確定其組成。通過氣相色譜獲得脂肪酸甲酯的單個峰，將脂肪酸甲酯峰的保留時間與單個標(biāo)準(zhǔn)的脂肪酸甲酯進行比較鑒定，并使用Agilent Technologies Chemstation A09.01軟件進行分析獲得脂肪酸的組成。

1.3.6γ-谷維素分析

采用Sakunpak等[27]改進的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對γ-谷維素進行鑒定和定量。使用帶有二極管陣列檢測器的Agilent Technolo gies 1100進行高效液相色譜分析。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）。40 ℃，使用乙腈-甲醇-異丙醇（25∶70∶5，V/V）組成的流動相分離樣品，流速為1 m L/m i n（18 min）。進樣量為20 μL，并通過檢測在298 nm和325 nm波長處測定吸光度確定γ-谷維素含量。

質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源的Agilent Technologies LC/MSD SL。以正電離模式獲得，具有以下參數(shù)：毛細管電壓4 000 V；霧化器壓力50 psi；氣體溫度350 ℃；烘干氣體，并記錄在m/z200～800質(zhì)量范圍內(nèi)的氣體。γ-谷維素由Agilent Mass Hunter軟件并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中指定的保留時間進行鑒定。

1.3.7 生育酚和生育三烯酚分析

采用Chen等[28]改進的反相高效液相色譜法分離米糠脂質(zhì)生育酚和生育三烯酚組分。高效液相色譜系統(tǒng)由安捷倫1100和二極管陣列探測器組成。通過紫外-可見分光光度法在波長298 nm和328 nm測定生育酚和生育三烯酚（α,β,γ,δ型）吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的保留時間確定生育酚和生育三烯酚。

1.3.8 植物甾醇分析

采用Thanh等[29]改進的方法，采用氣相色譜-質(zhì)譜法對甾醇進行定量和鑒定。檢測條件：DB-5ms 熔融石英毛細管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；使用Agilent Technologies 7683自動進樣器進樣1 μL樣品，分流比為1∶50。程序升溫：柱箱溫度最初設(shè)置為100 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升至300 ℃，保持14 min使用氦氣作為載氣，流速為1.5 mL/min。電離能設(shè)為70 eV。進樣器、質(zhì)譜四倍溫度、質(zhì)譜離子源和傳輸線分別為270、150、230 ℃和280 ℃。根據(jù)其保留時間和質(zhì)譜圖，通過SIM（單離子監(jiān)測）模式對植物甾醇進行鑒定和定量，此過程中膽甾烷用作內(nèi)標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗指標(biāo)的測定均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，數(shù)據(jù)采用Origin 8.5與Design Expert 8.0.6進行分析和繪制。用SPSS 17.0進行ANOVA單因素方差分析，并檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水酶法單因素試驗結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶添加量對米胚油提取率的影響

圖1 復(fù)合酶添加量對提取率的影響Fig. 1 Effect of enzyme concentration on the extraction efficiency of rice germ oil

當(dāng)料液比1∶5、酶解時間3 h時，考察復(fù)合酶添加量對米胚油提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。復(fù)合酶添加量在0.6%～1.2%時提取率逐漸上升（P＜0.05），這可能是因為隨著酶添加量的增大，底物與酶的接觸更加充分，米胚油也獲得更多的釋放[30]。當(dāng)復(fù)合酶添加量為1.2%時提取率高達87.5%。若繼續(xù)加大酶用量至1.4%時，提取率增加并不顯著（P＞0.05），這可能是因為底物與酶量有限，此時反應(yīng)已達到飽和。因此，考慮生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，選擇1.2%的復(fù)合酶添加量進行試驗。

2.1.2 料液比對米胚油提取率的影響

圖2 料液比對米胚油提取率的影響Fig. 2 Effect of ratio of material to liquid on the extraction efficiency of rice germ oil

當(dāng)復(fù)合酶添加量1.0%、酶解時間3 h時，考察料液比對米胚油提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。在料液比由1∶3變化到1∶5時提取率逐步升高（P＜0.05），其原因可能是在溶劑用量較小時，反應(yīng)體系濃度過高，流動性差，底物和酶未能充分接觸，也可能是酶解液黏稠度高，油脂分子遷移困難，使米胚油的提取率較低。但隨著溶劑用量的增加，體系流動性增強，酶能夠很好地與底物反應(yīng)，提取率也隨之提高。且當(dāng)料液比為1∶5時，提取率為86.9%。然而，當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加時，提取率逐漸降低（P＜0.05）。這可能是因為酶濃度和底物濃度降低，導(dǎo)致酶解效果不理想，影響了提取率[31]。因此，酶解料液比1∶5為最佳選擇。

2.1.3 酶解時間對米胚油提取率的影響

圖3 酶解時間對米胚油提取率的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of rice germ oil

當(dāng)料液比1∶5、酶添加量1.0%時，考察酶解時間對米胚油提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。在酶解時間為1 h時提取率僅有78.5%，這可能是因為底物與酶接觸時間短，反應(yīng)不完全使得米胚中的油脂依然禁錮在米胚細胞中沒能很好釋放[32]。在酶解時間為1～3 h時，隨著酶解時間延長反應(yīng)完全，提取率逐漸升高（P＜0.05）。且當(dāng)酶解時間延長到3 h時，復(fù)合酶對細胞壁和米胚蛋白充分作用，使米胚油提取率增大至86.5%。如果酶解時間繼續(xù)延長，提取率并無顯著升高（P＞0.05）。這可能是由于底物量與酶量有限，反應(yīng)已達飽和。因此，選取復(fù)合酶酶解3 h。

2.1.4 驗證實驗

通過對復(fù)合酶添加量、料液比、酶解時間的單因素試驗結(jié)果可知，水酶法提取米胚油最佳工藝條件為復(fù)合酶添加量1.2%、料液比1∶5、酶解時間3 h。在此最佳工藝條件下獲得的米胚油提取率為（87.4±0.04）%。

2.2 超聲波處理米胚的微觀結(jié)構(gòu)

圖4 不同處理條件的米胚微觀結(jié)構(gòu)Fig. 4 Ultrastructure of rice germ under different treatment conditions

王丹麗等[33]研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)某曁幚碛欣诩毎麅?nèi)物質(zhì)的浸出，因此初步選取超聲功率300 W、超聲溫度45 ℃、超聲時間15 min對稻米胚芽進行了超聲預(yù)處理，結(jié)果如圖4a所示，經(jīng)過超聲波處理的米胚，米胚細胞被破壞，細胞結(jié)構(gòu)不明顯，部分油脂體外露，部分油脂體與蛋白結(jié)合在一起；從圖4b發(fā)現(xiàn)經(jīng)過粉碎未經(jīng)過超聲處理的米胚，油脂體與蛋白結(jié)合在一起，分離不明顯，略有一點油脂體向外擴散，可能是由于粉碎作用使油脂體外露。經(jīng)過對比可看出未經(jīng)過超聲處理的米胚蛋白與油脂仍結(jié)合在一起，不利于油脂的提取，而經(jīng)過超聲波作用蛋白與油脂體明顯分離，再經(jīng)過后續(xù)酶的作用可以使米胚油更好地提取出來，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是高強度超聲引起的空化效應(yīng)，當(dāng)大振幅超聲波穿過米胚介質(zhì)時，引起介質(zhì)分子的壓縮和剪切，導(dǎo)致密度和彈性模量的局部變化[34]，結(jié)果初始的正弦壓縮波和剪切波將在距超聲換能器的有限距離處被扭曲成沖擊波，在負(fù)壓循環(huán)中鋸齒形超聲波邊緣處的壓力突然降低產(chǎn)生小氣泡，這些氣泡在正壓循環(huán)中坍塌并產(chǎn)生與高壓和高溫相關(guān)的湍流條件。此外，超聲波促進腫脹和水合，導(dǎo)致細胞壁中孔隙增大[35]，促進細胞內(nèi)米胚油流出從而改善提取性能[36]。因此，在提取米胚油時超聲處理是一種良好的輔助方法。并且采用這種方法可以獲得較高的油脂提取率[37]。

2.3 超聲波輔助水酶法提油的單因素試驗結(jié)果

2.3.1 超聲時間對米胚油提取率的影響

圖5 超聲時間對米胚油提取率的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of rice germ oil

在超聲功率300 W、超聲溫度45 ℃條件下對原料米胚進行超聲處理，然后在最佳的水酶法條件下提取油脂。由圖5可以看出，超聲時間在5～20 min內(nèi)米胚油的提取率隨著時間延長而逐漸上升（P＜0.05），超聲20 min時提取率為87.3%，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是由于暴露在超聲中的時間延長，會增加氣泡的形成，同時內(nèi)爆現(xiàn)象也會增加，使后續(xù)酶解反應(yīng)速率加快[38]。如果處理時間超過20 min時提取率會顯著降低（P＜0.05），這可能是因為長時間超聲處理，響應(yīng)會反轉(zhuǎn)，反應(yīng)系統(tǒng)狀態(tài)會乳化，“空化效應(yīng)”將削弱或消失，從而導(dǎo)致米胚油提取率降低。

2.3.2 超聲功率對米胚油提取率的影響

圖6 超聲功率對米胚油提取率的影響Fig. 6 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of rice germ oil

在超聲時間15 min、超聲溫度45 ℃條件下對原料米胚進行超聲處理，然后在最佳的水酶法條件下提取油脂。由圖6可以看出，在100～400 W時油脂提取率隨超聲功率的增加而逐漸增大（P＜0.05），且當(dāng)400 W時提取率為88.3%。這可能是因為超聲可以增強細胞的空化作用并通過機械振動促進油脂擴散，同時顆粒尺寸減小和催化表面積的增加，也有助于減少傳質(zhì)的限制，從而增大米胚油提取率[39]。然而功率增大到500 W時提取率顯著下降（P＜0.05），這可能是在較強超聲作用下導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，產(chǎn)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，從而降低油脂溶出[40]。

2.3.3 超聲溫度對米胚油提取率的影響

圖7 超聲溫度對米胚油提取率的影響Fig. 7 Effect of ultrasonic temperature on the extraction efficiency of rice germ oil

在超聲時間15 min、超聲功率300 W條件下對原料米胚進行超聲處理，然后在最佳的水酶法條件下提取油脂。由圖7可以發(fā)現(xiàn)，在超聲處理25～45 ℃時提取率呈下降趨勢，這可能是因為隨著超聲溫度的升高使原料米胚中脂肪酶活性增強，酶促反應(yīng)加劇，不利于油脂的提取。如果超聲溫度升高到55 ℃時提取率顯著增加 （P＜0.05），為88.7%。這可能是因為超聲溫度升高有助于提高底物的相容性，并改善傳質(zhì)，對后續(xù)酶解反應(yīng)的進行有促進作用。若溫度繼續(xù)升高到65 ℃時，提取率無明顯變化，這可能是由于在此超聲溫度下，瞬時空化的物理效應(yīng)所破壞的生物細胞已達最大限度，對油脂提取已無明顯影響[41]。

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。試驗號4、5、13、14、16為5 個中心試驗，用以估計試驗誤差，其余為析因試驗。將試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到超聲時間（A）、超聲功率（B）、超聲溫度（C）的回歸方程：R1=92.20-0.037A-0.24B＋0.15C-0.075AB-0.25AC- 0.10BC-3.31A2-4.11B2-3.84C2。利用Design Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design in terms of coded values with response variable

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

由表3可知，整體模型F值為68.88，P＜0.000 1，模型極顯著，回歸方程的因變量與自變量之間存在的線性關(guān)系明顯，表明這種試驗方法可靠。失擬項F值為5.55，P=0.065 6，失擬項不顯著，表明該模型選擇正確。模型中的調(diào)整系數(shù)R2Adj為0.974 5，說明97.45%的響應(yīng)值變化可以通過模型進行解釋，相關(guān)系數(shù)R2為0.988 8，說明該模型與試驗擬合良好。通過F值的大小判斷可得各個因素對米胚油的提取率的影響力[42]為B＞C＞A，即超聲功率＞超聲溫度＞超聲時間。

2.4.2 響應(yīng)面分析與最優(yōu)條件的確定

通過圖8中3 組響應(yīng)面及等高線的形狀分析3 個主要因素間的交互作用對米胚油提取率的影響，發(fā)現(xiàn)與AB相比，AC、BC等高線的形狀更接近橢圓形，因此判斷超聲功率、超聲時間與超聲溫度之間的交互作用比超聲功率與超聲時間之間的交互作用顯著。

利用Design Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進一步分析，并對擬合的回歸方程進行計算，預(yù)測超聲輔助水酶法提取米胚油的最佳工藝條件，在超聲溫度55.20 ℃、超聲功率398.53 W、超聲時間19.97 min條件下，米胚油的提取率達到92.21%。為考察結(jié)果的準(zhǔn)確性進行驗證實驗，結(jié)果如表4所示?？刂瞥暅囟?5 ℃、超聲功率400 W、在pH 7.0條件下超聲處理20 min，得到的米胚油實際提取率為（92.1±0.03）%。與預(yù)測值接近，其相對誤差僅為0.12%。表明在該試驗?zāi)Ｐ拖碌玫降淖罴压に嚄l件具有較高的可靠性。

圖8 不同超聲條件交互作用響應(yīng)面及等高線圖Fig. 8 Response surface and contour plots showing the interactive effect of different ultrasound conditions on the extraction efficiency of rice germ oil

表4 響應(yīng)面結(jié)果驗證實驗Table 4 Results of response surface optimization

2.5 米胚油提取率分析

通過對水酶法與超聲波輔助水酶法米胚油提取率的比較可知，超聲波輔助水酶法（92.1±0.03）%比水酶法（87.4±0.04）%提油的效果更好。

2.6 脂肪酸組成分析

表5 不同方法提取米胚油脂肪酸組成分析Table 5 Fatty acid composition of rice germ oil extracted by ultrasonicassisted and conventional aqueous enzymatic methods

由表5可以看出，米胚油中主要的不飽和脂肪酸是油酸和亞油酸，不飽和脂肪酸相對含量占70%以上，這與Bhatnagar等[43]的研究相比，脂肪酸組成略有差異，可能是由于不同的品種、氣候條件、處理方法等差異引起的。 由2 種提取米胚油方法的脂肪酸測定結(jié)果可知，超聲波輔助水酶法所提取米胚油與水酶法提取的油脂相比脂肪酸組成無明顯差別，且飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（20.62±0.14）%、 （39.62±0.96）%、（37.46±0.43）%，與FAO/WHO推薦的油脂中脂肪酸最佳比例較為接近[44]。

2.7 營養(yǎng)成分分析

表6 米胚油營養(yǎng)成分分析Table 6 Nutrient composition of rice germ oil extracted by ultrasonicassisted and conventional aqueous enzymatic

γ-谷維素、生育三烯酚和生育酚、植物甾醇是植物中重要的生物活性成分。由表6 可以看出，超聲波輔助水酶法提取米胚油的γ-谷維素和植物甾醇的含量分別為（4 9 0.0 0±2.1 2）m g/1 0 0 g 和（384.19±5.14） mg/100 g。超聲波輔助水酶法提取米胚油中生育酚的4 種異構(gòu)體齊全，總生育酚含量為（93.01±2.75）mg/100 g，與水酶法相比超聲輔助水酶法具有更高的提取效率。生育酚主要為α-生育酚和γ-生育酚，占生育酚總量的89%，生育三烯酚含量高達（64.78±1.50）mg/100 g，上述結(jié)果說明超聲輔助水酶法提取的米胚油中有更多的生物活性成分[45]。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗得到纖維素酶和中性蛋白酶復(fù)合酶通過水酶法提油的最佳條件，在復(fù)合酶添加量1.2%、料液比1∶5、酶解時間3 h時米胚油提取率為（87.4±0.04）%。 對米胚芽超聲處理，發(fā)現(xiàn)超聲處理米胚芽后植物細胞壁破壞明顯，已有油脂外露；這表明在超聲的空化作用下米胚蛋白和油脂更易分離。在最佳的復(fù)合酶酶解條件下優(yōu)化了超聲處理的工藝條件，得到在超聲溫度55 ℃、超聲功率400 W、超聲時間20 min時米胚油提取率為（92.1±0.03）%。與預(yù)測值相比，相對誤差僅為0.12%，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。通過氣相色譜分析法對米胚油的脂肪酸組成進行分析，發(fā)現(xiàn)米胚油中的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量比例與FAO/WHO推薦的油脂中脂肪酸最佳比例接近，且主要為油酸和亞油酸。通過與水酶法對比發(fā)現(xiàn)超聲處理米胚芽后油脂中的γ-谷維素、植物甾醇和生育酚含量升高。說明超聲波輔助水酶法提取的米胚油具有更多的抗氧化活性物質(zhì)。