FYa1泡菜用直投式發(fā)酵劑的制作工藝優(yōu)化

康 嬌，張亞蓉，楊從緒，薛橋麗，胡永金,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報編輯部，云南 昆明 650201）

云南傳統(tǒng)泡菜發(fā)酵加工工藝簡單，受發(fā)酵速度、品質(zhì)等方面受自然條件的影響大，且泡菜菌種和產(chǎn)品不穩(wěn)定、亞硝酸鹽含量高等諸多問題嚴(yán)重的制約著云南泡菜的發(fā)展。Pederson等[1]在1961年第一次把純種發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于泡菜的生產(chǎn)研究中。國內(nèi)對直投式發(fā)酵劑到20世紀(jì)90年代才開始進(jìn)行，到目前為止商業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵劑的公司還比較少，很多企業(yè)還只能依靠進(jìn)口購買發(fā)酵劑，因此發(fā)酵劑市場大部分依然被國外制備發(fā)酵劑的公司所占據(jù)[2-3]。

直投式乳酸菌發(fā)酵劑是采用優(yōu)質(zhì)乳酸菌進(jìn)行液體高密度培養(yǎng)后，經(jīng)過菌體細(xì)胞分離，與保護(hù)劑介質(zhì)混溶制備高濃度菌懸液，再經(jīng)冷凍干燥、無菌包裝后制成的一系列高濃度和標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)酵劑菌種[4]，具有活力高、接種量少、可直接應(yīng)用于生產(chǎn)等特點[5]。直投式乳酸菌發(fā)酵劑是目前發(fā)酵工業(yè)的一個研究熱點[6]。乳酸菌發(fā)酵劑的制備方法常使用真空冷凍干燥[7]，為降低冷凍干燥過程中細(xì)胞的死亡率，利用凍干保護(hù)劑可對細(xì)胞起到一定的保護(hù) 作用[8-9]，在凍干過程中，減輕或防止冷凍干燥時對菌體細(xì)胞物理、化學(xué)損傷或復(fù)水時對細(xì)胞的損害，保持原有的多種生物活性和各種理化特性，從而提高菌體存活率[10-11]。

從云南富源泡菜中分離得到的發(fā)酵乳桿菌FYa1，具有較高胞外多糖產(chǎn)量（約為175 mg/L），而許多胞外多糖都具有抗腫瘤[12-13]、抗氧化[14-16]、免疫調(diào)節(jié)[17-19]、降膽 固醇[20-21]、降血壓[22]、增強(qiáng)黏膜吸附作用[23]等生物活性。本研究旨在開發(fā)生長速度快、發(fā)酵活力高、發(fā)酵風(fēng)味好、亞硝酸鹽降解能力強(qiáng)的泡菜優(yōu)良發(fā)酵劑，為云南傳統(tǒng)泡菜科學(xué)加工和產(chǎn)品質(zhì)量提升提供一定科學(xué)理論和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）FYa1分離于云南富源酸菜，4 ℃斜面保存。

1.1.2 試劑

脫脂乳粉、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸鈉、谷氨酸、甘油、甘露醇（均為分析純） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；平板計數(shù)培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL 20M型冷凍離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司； FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 上海比郎儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 直投式泡菜發(fā)酵劑的工藝流程及操作要點

1）菌種活化：分離純化得到的優(yōu)勢菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2 次，得活化菌種。

2）菌種擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化的菌種按3%的接種量接種至優(yōu)化的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h。

3）離心收集菌泥：選擇適合的離心條件，盡量降低離心損失率和冷凍干燥時造成的細(xì)胞死亡率。以離心轉(zhuǎn)速、時間和溫度為參數(shù)，取發(fā)酵液至已滅菌的離心管中，離心后，棄上清液收集菌泥。加入等體積無菌生理鹽水打散混勻后，做梯度稀釋，選取適合濃度梯度，采用平板計數(shù)法測定FYa1活菌數(shù)。

4）菌懸液的制備：將凍干保護(hù)劑溶解制成相應(yīng)濃度的溶液，121 ℃滅菌15 min備用。發(fā)酵液離心后棄去上清液，菌泥中分別加入配制滅菌后的保護(hù)劑，保護(hù)劑添加量為離心前菌液體積的1/10，混合均勻。菌懸液配制好后采用梯度稀釋平板法進(jìn)行活菌計數(shù)。

5）預(yù)冷凍：在真空冷凍干燥菌種的過程中，微生物存活率與凍結(jié)速度有極其重要的關(guān)系。為提高乳酸菌對低溫環(huán)境的適應(yīng)能力，將制備好的菌懸液放入-80 ℃冷凍室4 h[24]，進(jìn)行預(yù)冷凍，使其凍結(jié)均勻。

6）真空冷凍干燥：待菌懸液凍結(jié)完全后，迅速取出轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，開啟真空泵，直至形成干燥菌粉。凍干條件為真空度9.7 Pa、冷阱溫度-50 ℃，凍干時間約18 h。凍干后取干燥菌粉測定活菌總數(shù)，計算凍干存活率。

7）活菌計數(shù)：凍干后的菌粉，加入與保護(hù)劑相同體積無菌水溶解，采用梯度稀釋法，選擇合適的稀釋度，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.3.2 直投式泡菜發(fā)酵劑離心條件的篩選

采用單因素配合正交試驗，以FYa1離心存活率作為測量指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵劑的離心條件。

1.3.2.1 單因素試驗

考察離心轉(zhuǎn)速（2 000、4 000、6 000、8 000 r/min）對FYa1存活率的影響時，固定離心溫度4 ℃、離心時間10 min。選取離心存活率較高轉(zhuǎn)速，在一定離心溫度（4、10、15、20、25 ℃）下，離心10 min。在之前實驗的基礎(chǔ)上，選取離心存活率較高轉(zhuǎn)速和離心溫度，比較在不同離心時間（10、20、30、40 min）下，F(xiàn)Ya1的離心存活率。計算不同離心條件下FYa1的離心存活率。

1.3.2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用L9（34)正交試驗，對離心轉(zhuǎn)速、離心溫度、離心時間進(jìn)行優(yōu)化，確定FYa1的最佳離心條件。正交因素與水平設(shè)計見表1。

表1 發(fā)酵劑離心條件正交試驗因素與水平Table 1 Level and code of independent variables used for orthogonal array design

1.3.3 直投式泡菜發(fā)酵劑冷凍干燥保護(hù)劑的復(fù)配優(yōu)化

1.3.3.1 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗設(shè)計用于Box-Behnken試驗前挑選優(yōu)化因素。結(jié)合參考文獻(xiàn)[25-26]對影響乳酸菌冷凍干燥存活率的相關(guān)因素，對脫脂乳粉、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸鈉、谷氨酸、甘油、甘露醇進(jìn)行初步考察，檢測凍干存活率。因素與水平設(shè)計見表2。

表2 發(fā)酵劑冷凍干燥保護(hù)劑水平Table 2 Code and level of independent variables used for Plackett-Burman design%

1.3.3.2 Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化最佳保護(hù)劑配方

根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計的結(jié)果，從中選取海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉用量為影響凍干存活率的3 個主要因素，以凍干存活率作為響應(yīng)值（Y），設(shè)計Box-Behnken試驗，確定最佳凍干保護(hù)劑的配方。試驗因素及水平設(shè)計見表3。

表3 Box-Behnken試驗因素與水平Table 3 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design g/100 mL

1.3.4 直投式泡菜發(fā)酵劑的發(fā)酵性能檢測

為探究直投式泡菜發(fā)酵劑在實際發(fā)酵中的發(fā)酵活性，將優(yōu)化后所得直投式發(fā)酵劑接種到蘿卜泡菜中進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.4.1 泡菜制備

以蘿卜為原料，均勻切成邊長2 cm正方體形，開水漂燙1 min，瀝水備用。將處理好的蘿卜以1 kg每瓶分裝于泡菜瓶中，按料液比1∶1（kg/L）加入水，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%直投式泡菜發(fā)酵劑（添加前溫水復(fù)活30 min），37 ℃發(fā)酵，取前中后末期樣品各1 次，直至發(fā)酵終點。測定泡菜發(fā)酵過程中微生物指標(biāo)（菌落總數(shù)、霉菌、酵母、乳酸菌及致病菌）。

1.3.4.2 微生物指標(biāo)測定

菌落總數(shù)參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢測 菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)》[27]；霉菌和酵母總數(shù)的測定采用平板計數(shù)法，參照GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢測 霉菌和酵母菌計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)》[28]；大腸菌群參照GB 4789.3—2010《食品微生物學(xué)檢測 大腸菌群計數(shù)》[29]；乳酸菌參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢測 乳酸菌總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)》[30]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0、Minitab 17進(jìn)行試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析；采用Origin制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 直投式泡菜發(fā)酵劑離心條件的篩選

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

圖1 離心轉(zhuǎn)速（A）、離心溫度（B）以及離心時間（C）對 FYa1存活率的影響Fig. 1 Effects of centrifugation speed (A), temperature (B) and time (C) on survival rate of FYa1

由圖1可知，F(xiàn)Ya1存活率隨轉(zhuǎn)速的升高，呈先上升后下降的趨勢，在4 000 r/min時存活率達(dá)到峰值，后離心存活率持續(xù)下降。離心存活率隨著離心溫度的升高總體呈下降趨勢，存活率在4～15 ℃時處于較高水平。隨著離心時間的延長離心存活率總體呈下降趨勢，離心達(dá)40 min時，有小幅上升現(xiàn)象，但幅度不大。故綜合考量，選取轉(zhuǎn)速4 000 r/min、離心溫度4～15 ℃、離心時間10 min進(jìn)行后續(xù)正交試驗，優(yōu)化離心條件。

2.1.2 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵劑離心條件

離心轉(zhuǎn)速、離心時間、離心溫度極差分別為4.754、20.037、7.620，極差越大表明該因素對FYa1離心存活率的影響越顯著，因此離心條件對菌株的離心存活率的影響的主次順序依次為：離心時間＞離心溫度＞離心轉(zhuǎn)速。由k值 可知，離心條件各因素的最佳組合為A1B3C3，即離心轉(zhuǎn)速3 000 r/min、離心時間15 min、離心溫度15 ℃，在這個條件下，F(xiàn)Ya1離心存活率達(dá)到了34.57%（表4）。

表4 發(fā)酵劑離心條件正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Orthogonal array design with experimental results for optimization of centrifugation conditions

2.2 直投式泡菜發(fā)酵劑冷凍干燥保護(hù)劑的復(fù)配優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果

表5 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Fig. 5 Plackett-Burman design with experimental results

通過Plackett-Burman試驗設(shè)計，對脫脂乳粉、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸鈉、谷氨酸、甘油、甘露醇8 種凍干保護(hù)劑進(jìn)行初步考察，篩選出對FYa1凍干存活率影響較顯著的因素，試驗設(shè)計及FYa1凍干存活率響應(yīng)值結(jié)果見表5。FYa1凍干存活率在38.7%～62.3%之間，經(jīng)方差分析后，可分析各干燥劑對FYa1凍干存活率的影響，從而篩選出主要影響因素。

表6 Plackett-Burman試驗結(jié)果方差分析Table 6 Analysis of variance of Plackett-Burman design results

從表6可知，除葡萄糖、谷氨酸和甘露醇對FYa1凍干存活率的影響為負(fù)效應(yīng)外，其他均表現(xiàn)為正效應(yīng)，并且海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉3 個因素的效應(yīng)值最大，且P值均小于0.05，表明海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉對FYa1凍干存活率影響顯著，其他因素則沒有顯著性差異。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)Pareto圖Fig. 2 Pareto chart of the standardized effect

由圖2可知，各因素對FYa1的凍干存活率影響顯著程度依次為：海藻糖＞蔗糖＞谷氨酸鈉＞葡萄糖＞甘油＞谷氨酸＞脫脂乳粉＞甘露醇。其中，海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），是決定FYa1凍干存活率的重要因素。因此選擇海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉作為主要影響因素，進(jìn)行進(jìn)一步的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化復(fù)配冷凍干燥保護(hù)劑。

2.2.2 Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化最佳保護(hù)劑配方

根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果，進(jìn)一步用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化凍干保護(hù)劑的配方，以FYa1凍干存活率（Y）為響應(yīng)值，試驗設(shè)計與結(jié)果如表7所示。

表7 凍干保護(hù)劑Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Box-Behnken design with experimental results

采用Minitab17軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，獲得FYa1凍干存活率的二次回歸擬合多項式方程為：Y對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。

表8 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 8 Analysis of variance of Box-Behnken design results

該模型顯著（P=0.005 7＜0.01），失擬不顯著（P=0.491 3＞0.05），模型的F值為13.02，該模型的R2為0.959 1、R2Adj為0.885 4表明試驗所采用的模型擬合程度良好，在統(tǒng)計學(xué)上有意義。各因素中、、對響應(yīng)值凍干存活率影響極顯著（P＜0.01），其余因素對凍干存活率影響并不顯著（P＞0.05）。各因素與響應(yīng)值凍干存活率之間的關(guān)系可以通過回歸方程描述，可以利用該模型預(yù)測凍干保護(hù)劑的配方和菌體凍干存活率。海藻糖、蔗糖和谷氨酸鈉對FYa1凍干存活率影響的等高線和響應(yīng)面如圖3所示。

圖3 各因素交互作用下FYa1凍干存活率的等高線和響應(yīng)面圖Fig. 3 Contour and response surface plots showing the interactive effects of trehalose, sucrose and sodium glutamate on the survival rate of lyophilized FYa1

分析回歸方程Y，得到8.5 g/1 00 mL海藻糖、8.5 g/100 mL蔗糖和2.5 g/100mL谷氨酸鈉時的最大響應(yīng)值。通過驗證實驗驗證模型方程預(yù)測最優(yōu)響應(yīng)值的適用性。凍干菌粉的存活率為（68.53±0.09）%，此時測得FYa1發(fā)酵劑的含菌量為（2.0±0.05）×108CFU/g。

2.3 直投式泡菜發(fā)酵劑的發(fā)酵性能

FYa1發(fā)酵劑及老湯發(fā)酵的泡菜，發(fā)酵過程各微生物指標(biāo)測定結(jié)果如表9所示。FYa1發(fā)酵劑泡菜的菌落總數(shù)在第0小時為2.8×105CFU/mL，隨時間的延長泡菜中細(xì)菌迅速增殖，10 h菌落總數(shù)略微下降，之后趨于平穩(wěn)。乳酸菌數(shù)在第0小時為9.7×104CFU/mL，經(jīng)過5 h發(fā)酵后，發(fā)酵劑泡菜中乳酸菌數(shù)增加至6.7×108CFU/mL，之后基本趨于穩(wěn)定。酵母菌數(shù)隨發(fā)酵進(jìn)行不斷減少，10 h后直至發(fā)酵結(jié)束都未被檢測出。發(fā)酵過程中均未檢測出霉菌與大腸菌群。

表9 微生物指標(biāo)變化Table 9 Changes in microbial populations in the DVS during pickle fermentation

綜合分析，雖然發(fā)酵前期FYa1發(fā)酵劑泡菜中菌落總數(shù)與酵母菌數(shù)較少，但隨著發(fā)酵進(jìn)行，F(xiàn)Ya1迅速成為優(yōu)勢菌群，累積乳酸降低發(fā)酵環(huán)境中的酸度，從而抑制其他雜菌，比如酵母菌的生長，故第10小時未檢測出酵母菌以至于菌落總數(shù)出現(xiàn)略微降低。這證明FYa1發(fā)酵劑具有優(yōu)秀的發(fā)酵性能，在發(fā)酵過程中展現(xiàn)出良好的復(fù)活能力。

3 結(jié) 論

FYa1直投式泡菜發(fā)酵劑的最佳離心條件為離心轉(zhuǎn)速3 000 r/min、離心時間15 min、離心溫度15 ℃，在此條件下，F(xiàn)Ya1離心存活率達(dá)到了34.57%。凍干保護(hù)劑的最佳配比為8.5 g/100 mL海藻糖、8.5 g/100 mL蔗糖和2.5 g/m L 谷氨酸鈉，凍干菌粉的存活率為（68.53±0.09）%，此時測得FYa1直投式泡菜發(fā)酵劑的含菌量為（2.0±0.05）×108CFU/g。FYa1直投式泡菜發(fā)酵劑具有優(yōu)秀的發(fā)酵性能，在發(fā)酵過程中展現(xiàn)出良好的復(fù)活能力。