熱處理?xiàng)l件對(duì)巴氏殺菌乳風(fēng)味品質(zhì)的影響

楊?yuàn)檴?，丁瑞雪，史海粟，?雪，楊 梅，岳喜慶，武俊瑞

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

巴氏殺菌乳因其殺菌條件溫和、較好保留了原料乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味，受到消費(fèi)者的廣泛喜愛(ài)[1-2]。與超高溫瞬時(shí)殺菌乳相比，巴氏殺菌乳熱處理溫度低，蛋白質(zhì)變性程度較小，脂肪氧化程度低，不易產(chǎn)生蒸煮味、脂肪氧化味、焦糊味等不良風(fēng)味，較好的保留了原料乳中的風(fēng)味[3]。

對(duì)于乳品的風(fēng)味測(cè)定，傳統(tǒng)方法主要采用溶劑萃取、蒸餾萃取和感官鑒定等方法，然而這些方法存在耗時(shí)、結(jié)果不精確等缺點(diǎn)。隨著風(fēng)味檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，電子舌、電子鼻、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等高新檢測(cè)技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于乳品風(fēng)味檢測(cè)中[4-6]。相關(guān)研究表明，不同熱處理?xiàng)l件下的牛乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在含量及組成等方面具有明顯差異[7-8]。巴氏殺菌乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要有酮、酯、醛、酸等，在加工過(guò)程中，其含量處于動(dòng)態(tài)變化，對(duì)巴氏殺菌乳風(fēng)味的形成起著重要作用[9]。電子舌作為一種新興的智能感官儀器，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于乳品行業(yè)，如摻偽檢測(cè)、新鮮度評(píng)定以及不同來(lái)源牛乳樣品的區(qū)分等[10-11]。頂空固相微萃取-GC-MS聯(lián)用技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、靈敏度高被廣泛應(yīng)用于食品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)中[12-14]。研究表明，游離氨基酸含量與熱處理有關(guān)，而一些氨基酸具有呈味特性，因此測(cè)定乳中呈味氨基酸的含量對(duì)風(fēng)味品質(zhì)影響尤為重要[15]。全自動(dòng)氨基酸儀能夠較為準(zhǔn)確地測(cè)定乳品中的游離氨基酸含量，具有準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)便、儀器穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)采用電子舌、GC-MS以及全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)不同熱處理?xiàng)l件下的巴氏殺菌乳風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行對(duì)比分析，以期為巴氏殺菌乳的生產(chǎn)加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳樣品采自沈陽(yáng)輝山乳業(yè)有限公司，置于醫(yī)用冷藏箱中，于2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并在4 ℃保存。

2-甲基-3-庚酮（分析純） 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；5-磺基水楊酸（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-86L338(J)超低溫冰箱、TGL-168高速臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；InsentSA402B電子舌 日本Insent 公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB固相微萃取纖維 美國(guó) Supelco公司；7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將采集的鮮牛乳樣品參照目前我國(guó)乳品工業(yè)中常用的熱處理方法以及借鑒美國(guó)食品藥品管理局相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，制定巴氏殺菌乳熱處理工藝的方法，流程如下：采集生鮮牛乳→預(yù)熱→巴氏殺菌。

巴氏殺菌條件分為2 組：1）低溫長(zhǎng)時(shí)間殺菌：利用水浴鍋進(jìn)行，在62、65、68 ℃分別殺菌20、25、30 min和35 min；2）高溫短時(shí)間殺菌：采用輝山乳業(yè)的中試型巴氏殺菌設(shè)備，在72、75、80、83 ℃和85 ℃分別殺菌15、20 、30 s，所有技術(shù)規(guī)范按照中國(guó)奶業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。樣品處理結(jié)束后，分裝冷凍于-80 ℃冰箱中待測(cè)。

1.3.2 電子舌味感的測(cè)定

取適量體積的巴氏殺菌乳置于電子舌測(cè)定專(zhuān)用的小杯中，利用電化學(xué)傳感器原理測(cè)定巴氏殺菌乳樣品的綜合味覺(jué)信息，從而對(duì)被測(cè)試樣進(jìn)行定量和定性分析。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定酸、甜、苦、澀、咸、鮮6 種味感的豐富度。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味成分的測(cè)定

根據(jù)張曉梅等[18]的研究方法稍作修正。取10 g牛乳樣品置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入0.5 g NaCl、10 μL 2-甲基-3-庚酮（1 μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品，用鋁蓋封口，鋁蓋內(nèi)由進(jìn)樣針針頭可刺穿的聚四氟乙烯和硅膠墊密封。將樣品瓶置于50 ℃水浴鍋中加熱并快速攪拌，平衡5 min后，在50 ℃條件下吸附40 min后將吸附層收回到針頭并移出樣品瓶，利用GC-MS儀進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定，GC-MS條件設(shè)置借鑒Vazquez-Landaverde等[19]的方法。

G C 條件：色譜柱為D B-5 非極性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱流速1 mL/min，載氣為高純氦氣，檢測(cè)器溫度250 ℃，進(jìn)樣器溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；程序升溫：35 ℃保持1 min，以10 ℃/min升到110 ℃，以0.5 ℃/min升到115 ℃，再以6 ℃/min升到160 ℃，最后以10 ℃/min升到200 ℃，保持8 min。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，質(zhì)量掃描范圍40～350 u。

1.3.4 游離氨基酸含量的測(cè)定

根據(jù)吳尚儀等[20]的方法稍作改進(jìn)，分別取各巴氏殺菌乳樣品2 mL，以轉(zhuǎn)速15 000 r/min離心15 min，取上清液并加入2 mL 5%磺基水楊酸溶液以1∶1比例混合均勻，再次將混合液以轉(zhuǎn)速15 000 r/min離心20 min，吸取上清液800 μL過(guò)0.22 μm的水系濾頭，注入2 mL的氨基酸進(jìn)樣瓶中，備用、待測(cè)。

利用L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸含量的測(cè)定，儀器柱溫57.0 ℃，反應(yīng)柱溫135 ℃，泵1流速為0.45 mL/min，泵2流速為0.35 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。紫外檢測(cè)器：脯氨酸在波長(zhǎng)440 nm處測(cè)定吸光度，其他氨基酸在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度。氨基酸含量通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品中氨基酸積分含量作為參考，最終獲得各巴氏殺菌乳中16 種氨基酸的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 電子舌

對(duì)不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳的酸、苦、澀、鮮、甜、咸、豐富性的味感值進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，繪制雷達(dá)圖并進(jìn)行味感值的相關(guān)性分析。

1.4.2 GC-MS

通過(guò)Excel 2010軟件對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總處理，SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類(lèi)分析。

1.4.3 游離氨基酸

通過(guò)Excel 2010軟件對(duì)游離氨基酸數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總處理，Origin 2018軟件繪制熱圖并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子舌評(píng)價(jià)分析

2.1.1 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳電子舌雷達(dá)圖分析

圖1 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳味感值雷達(dá)圖Fig. 1 Radar maps of taste values of pasteurized milk under different heat treatment conditions

如圖1所示，利用電子舌傳感器對(duì)不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳的酸、苦、澀、鮮、豐富性、咸、甜等味感值進(jìn)行測(cè)定，其中豐富性味感值最大，酸的味感值最小，其他味感值介于兩者之間。低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌組（圖1A）與原料乳相比，在68 ℃殺菌35 min時(shí)澀的味感值變化較為明顯，造成此現(xiàn)象的原因可能是由于長(zhǎng)時(shí)間殺菌導(dǎo)致巴氏殺菌乳中蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生了一些小分子呈味肽[21]；而其他幾種味感值與原料乳相比，無(wú)明顯變化。高溫短時(shí)巴氏殺菌組（圖1B）與原料乳相比，各味感值均無(wú)明顯變化，說(shuō)明高溫短時(shí)巴氏殺菌能較好地保留原料乳中的風(fēng)味[22]。

2.1.2 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳味感值的相關(guān)性分析

表1 味感值的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis among taste values

如表1所示，甜的味感值和酸、鮮呈顯著正相關(guān)；咸的味感值和酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，與苦和鮮呈極顯著正相關(guān)；豐富性與酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，與苦、鮮、咸呈極顯著正相關(guān)。由此可見(jiàn)，不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳味感值之間具有一定的相關(guān)性。

2.2 GC-MS測(cè)定結(jié)果

2.2.1 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

如圖2所示，利用GC-MS技術(shù)檢測(cè)不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳中的風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果表明：原料乳中共有19 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要為醇、酯、烷、酸等物質(zhì)；11 種加熱后消失，8 種受熱處理?xiàng)l件影響在含量上發(fā)生變化，共產(chǎn)生了42 種新物質(zhì)。低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌組 （圖2A）中，烷類(lèi)、醛類(lèi)物質(zhì)的含量無(wú)明顯變化；在同一溫度下，酯類(lèi)物質(zhì)的含量隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)增加，但隨著溫度的上升，其含量減少。乳中酯類(lèi)物質(zhì)是通過(guò)脂肪酸與脂肪醇發(fā)生酯化反應(yīng)形成的，通常酯類(lèi)物質(zhì)具有特殊的香氣，對(duì)乳的風(fēng)味形成具有重要作用[23-24]。 酸類(lèi)物質(zhì)含量隨溫度變化較為明顯，隨著殺菌時(shí)間的延長(zhǎng)，酸類(lèi)物質(zhì)含量升高，這可能是由于熱處理導(dǎo)致乳中脂肪的水解，產(chǎn)生了脂肪酸[25]。醇類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)無(wú)明顯變化，但含量有所提升。高溫短時(shí)巴氏殺菌組 （圖2B）中，酚、醛、酮三類(lèi)物質(zhì)變化較為明顯。醛類(lèi)共有5 種，新產(chǎn)生了4 種醛類(lèi)物質(zhì)，在80 ℃和83 ℃時(shí)其含量增加。醛類(lèi)物質(zhì)也是乳中風(fēng)味物質(zhì)的主要成分，是乳中脂肪氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物[26-27]。原料乳中沒(méi)有酮類(lèi)，均通過(guò)加熱處理產(chǎn)生，但當(dāng)溫度升高到83 ℃時(shí)，酮類(lèi)物質(zhì)基本消失。酮類(lèi)物質(zhì)是脂肪β氧化的產(chǎn)物，是乳風(fēng)味物質(zhì)的主要組成成分[28-29]。酚類(lèi)物質(zhì)在72 ℃時(shí)產(chǎn)生，溫度較低時(shí)不利于酚類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生。

圖2 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)數(shù)對(duì)比Fig. 2 Comparison of volatile flavor compounds in pasteurized milk under different heat treatment conditions

2.2.2 PCA結(jié)果

圖3 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)PCAFig. 3 PCA of volatile flavor compounds in pasteurized milk under different heat treatment conditions

由圖3可知，PC1貢獻(xiàn)率為79.82%，PC2貢獻(xiàn)率為8.9%，二者整體貢獻(xiàn)率超過(guò)80%，說(shuō)明該P(yáng)CA能夠反映出不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)差異。兩樣本點(diǎn)間的距離越近，說(shuō)明兩樣本的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)組成越相似。從圖3可以看出，不同條件熱處理對(duì)巴氏殺菌乳的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)影響顯著，原料乳、低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌組和高溫短時(shí)巴氏殺菌組各自聚為一簇，2 個(gè)熱處理組別的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)也各不相同。低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌組中，醇、酯、酸、烷類(lèi)物質(zhì)較為豐富；而高溫短時(shí)巴氏殺菌組中，酚、醛、酮類(lèi)物質(zhì)較多。

2.2.3 聚類(lèi)分析

圖4 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)聚類(lèi)分析Fig. 4 Cluster analysis of volatile flavor compounds in pasteurized milk under different heat treatment conditions

由圖4可知，7 類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)被聚為3 類(lèi)，第1類(lèi)為酚、醛、酮，是高溫短時(shí)殺菌組產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)；第2類(lèi)為酯、酸、醇，主要由低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌組產(chǎn)生；第3類(lèi)為烷類(lèi)物質(zhì)，乳中的烷類(lèi)物質(zhì)可能來(lái)源于飼料，經(jīng)過(guò)消化轉(zhuǎn)移到乳中[30]。該結(jié)果與圖3結(jié)果基本保持一致，較好反映不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異性。

2.3 氨基酸測(cè)定結(jié)果

2.3.1 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳中游離氨基酸測(cè)定結(jié)果

圖5 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳游離氨基酸含量熱圖Fig. 5 Heat map of free amino acids in pasteurized milk under different heat treatment conditions

利用全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳的游離氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，并采用Origin 2018軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，并繪制非聚類(lèi)熱圖。如圖5所示，紅色越深，表示游離氨基酸含量越高；藍(lán)色越深，表示游離氨基酸含量越低。不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳中的酪氨酸（Tyr）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、蛋氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）的含量很少，且含量幾乎不隨熱處理?xiàng)l件變化而變化；其他游離氨基酸含量較高，并且隨熱處理?xiàng)l件的改變，呈無(wú)規(guī)則變化，這一結(jié)果與宋慧敏[31]的研究結(jié)果一致。相關(guān)研究表明，乳中存在的耐熱酶在熱處理過(guò)程中會(huì)使蛋白質(zhì)酶解，導(dǎo)致游離氨基酸的含量增加；并且在熱處理過(guò)程中，氨基酸自身也會(huì)發(fā)生裂解，或與乳中的糖類(lèi)物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致游離氨基酸數(shù)量減少[32-34]，這可能是本研究巴氏殺菌乳中的游離氨基酸含量隨熱處理?xiàng)l件的改變，發(fā)生無(wú)規(guī)則變化的原因。

2.3.2 不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳中呈味氨基酸分析

表2 呈味氨基酸含量及所占比例Table 2 Contents of taste amino acids and their proportions relative to total amino acids

游離氨基酸的呈味特性與側(cè)鏈R基團(tuán)的疏水性有關(guān)，當(dāng)氨基酸的疏水性較小時(shí)，氨基酸呈甜味，如絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸等；當(dāng)氨基酸的疏水性較大時(shí)，氨基酸呈苦味，如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸等；當(dāng)側(cè)鏈為酸性基團(tuán)時(shí)，氨基酸呈鮮味或酸味，如谷氨酸和天冬氨酸[35-36]。將不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳中的游離氨基酸按呈味特性進(jìn)行劃分，并對(duì)呈味氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及所占比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表2所示。

從表2可以看出，低溫長(zhǎng)時(shí)殺菌組鮮味氨基酸占比隨殺菌溫度升高、殺菌時(shí)間延長(zhǎng)大致呈上升趨勢(shì)，在68 ℃、30 min時(shí)達(dá)到最高值63.65%；高溫短時(shí)殺菌組鮮味氨基酸占比呈現(xiàn)規(guī)律波動(dòng)趨勢(shì)，在75 ℃、30 s和83 ℃、20 s達(dá)到高峰，之后又下降?？辔栋被崴急壤诘蜏亻L(zhǎng)時(shí)殺菌組無(wú)明顯變化；在高溫短時(shí)殺菌組，苦味氨基酸所占比例與原料乳相比有所提高，隨殺菌條件的改變，所占比例無(wú)規(guī)則波動(dòng)。甜味氨基酸所占比例幾乎不隨殺菌條件改變，但在75 ℃、20 s時(shí)，甜味氨基酸所占比例突然增加，并達(dá)到最大值45.36%，其原因有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

不同熱處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳的味感值之間具有一定的相關(guān)性，高溫短時(shí)巴氏殺菌組與原料乳的味感值更接近，能較好地保留原料乳中的風(fēng)味。原料乳中共有19 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢出，而其中11 種熱處理后均消失，其余8 種物質(zhì)的含量受熱處理?xiàng)l件的不同而發(fā)生變化。同時(shí)，牛乳經(jīng)熱處理后共產(chǎn)生了42 種新物質(zhì)。低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌有利于鮮味氨基酸的產(chǎn)生，高溫短時(shí)殺菌使乳中苦味氨基酸的含量提高。由此可見(jiàn)，不同的熱處理方式對(duì)巴氏殺菌乳的風(fēng)味品質(zhì)有不同的影響。在滿(mǎn)足殺菌和產(chǎn)品工藝要求情況下，隨著人民生活水平的不斷提高，對(duì)于巴氏殺菌乳風(fēng)味品質(zhì)的個(gè)性化要求會(huì)越來(lái)越多，因此本研究將為針對(duì)不同消費(fèi)者風(fēng)味營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)差異化市場(chǎng)需求，適當(dāng)調(diào)整和細(xì)化個(gè)別工藝條件，生產(chǎn)加工不同風(fēng)味品質(zhì)的差異化產(chǎn)品提供依據(jù)。