結(jié)合淀粉活性乳酸菌利用生淀粉產(chǎn)酶條件及代謝產(chǎn)物

郭浩男，張莉力，馮琳琳，王天琪，王 成，趙昕琪，許云賀

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

腸道微生物作為人體微生物群中種類最豐富的生態(tài)系統(tǒng)之一，微生物群高度多樣，在這個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)中，乳酸菌屬既是非消化性碳水化合物發(fā)酵的貢獻(xiàn)者，也是乳酸、醋酸等有機(jī)酸的生產(chǎn)者，產(chǎn)生的有機(jī)酸及短鏈脂肪酸具有調(diào)節(jié)腸道pH值、抑制腸道有害菌生長(zhǎng)的功能[1]。 因此，為了促進(jìn)胃腸道健康，人們食用發(fā)酵制品或含有乳酸菌等益生菌的制品作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，但考慮到腸道菌群對(duì)外來(lái)菌的定植抗性等因素，同時(shí)服用被這些益生菌選擇性代謝的益生元更是尤為重要[2]。低聚果糖、低聚麥芽糖等是眾所周知的益生元，在益生性食品加工中應(yīng)用廣泛[3-6]。Makras等[7]發(fā)現(xiàn)，有些乳酸桿菌通過(guò)分泌β-果糖苷酶水解利用菊粉型低聚果糖，且利用不同長(zhǎng)度及聚合度的低聚果糖，其代謝產(chǎn)物也不同。Zhang Yi等[8]研究表明，蓮子III型抗性淀粉對(duì)雙歧桿菌具有比葡萄糖等單糖更好的增殖作用。然而，由于烹飪條件及飲食習(xí)慣等原因，人結(jié)腸中存在大量未被人體消化代謝的碳水化合物，如未經(jīng)糊化的生淀粉、老化淀粉等不同類型的抗性淀粉，這些淀粉作為潛在益生元存在于結(jié)腸中[9]。因此，尋找1 株可代謝這種“天然益生元”的益生菌意義重大，但目前對(duì)這類具有代謝生淀粉能力的益生性乳酸菌研究較少。

課題組前期在酸漿法沉降加工淀粉的研究中發(fā)現(xiàn)，從自然發(fā)酵酸漿中分離的乳酸菌能夠與淀粉特異性結(jié)合，將眾多的淀粉顆粒凝集成大的絮凝體，達(dá)到沉降效果[10-13]，并對(duì)其益生性進(jìn)行了評(píng)價(jià)[14]。淀粉經(jīng)過(guò)具有淀粉結(jié)合活性乳酸菌發(fā)酵后，可以顯著改變淀粉的化學(xué)成分、直鏈淀粉含量、淀粉老化速率、黏度及其溶解度和膨潤(rùn)力[15]。Crittenden等[16]研究表明，一些雙歧桿菌的菌株能夠結(jié)合到淀粉顆粒表面，而這些能結(jié)合到淀粉顆粒上的菌均具有分泌淀粉酶并代謝淀粉的能力。Ze等[17]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸內(nèi)的布氏瘤胃球菌屬利用淀粉時(shí)，淀粉水解蛋白與淀粉黏連蛋白結(jié)合在一起，構(gòu)成了一個(gè)對(duì)生淀粉顆粒水解作用的“淀粉小體”結(jié)構(gòu)。菌體表面具有淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的酶與淀粉或低聚糖水解能力的糖苷水解酶GH13家族的酶相互錨定[18-19]。由此推測(cè)，微生物對(duì)基質(zhì)的黏附為其代謝該基質(zhì)提供了有利條件。生淀粉酶是指對(duì)不經(jīng)過(guò)蒸煮糊化的生淀粉顆粒能表現(xiàn)出水解活性的一類酶[20]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，初步證明了具有特異性結(jié)合淀粉活性的副干酪乳桿菌L1有代謝生淀粉的能力，推測(cè)L1具有分泌生淀粉酶的能力。

因此，選用1 株具有特異性結(jié)合淀粉活性的副干酪乳桿菌L1為研究對(duì)象，通過(guò)在生淀粉基質(zhì)中培養(yǎng)，分析其產(chǎn)酶性質(zhì)，純化后確定蛋白分子質(zhì)量，觀察L1在不同來(lái)源生淀粉基質(zhì)中的產(chǎn)酶情況，對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)水解淀粉過(guò)程中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，對(duì)乳酸菌在淀粉類基質(zhì)中的應(yīng)用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

副干酪乳桿菌L1由錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存，該菌株已保藏到中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC4163）。

1.1.2 試劑

甘薯、綠豆淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉均為市購(gòu)；可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈、磷酸均為 色譜純；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

甘薯汁培養(yǎng)基：甘薯200 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，牛肉膏5 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖22 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min（前期優(yōu)化的L1最優(yōu)培養(yǎng)基）。

MRS肉湯培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g,牛肉膏5 g，酵母浸粉4 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸三銨2 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL。

tMRS培養(yǎng)基：未添加碳源的MRS肉湯培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JB-VS-1300超凈工作臺(tái) 金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；T20MM立式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；LC-15C型高效液相色譜儀（配有RID示差檢測(cè)器） 島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；Mini-Trans-Blot電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

取-80 ℃冰箱保存的菌種以10%接種量接于甘薯汁培養(yǎng)基，31 ℃培養(yǎng)24 h后，以4%接種量依次傳代，至菌液恢復(fù)絮凝活力后，擴(kuò)大培養(yǎng)后備用，所有步驟均在超凈臺(tái)中操作。

1.3.2 L1產(chǎn)酶位置分析

將活化后的L1種子菌液以4%接種量接入無(wú)碳源的甘薯汁培養(yǎng)基，種子菌液用無(wú)菌水稀釋至OD600nm為1.0，生淀粉在熱空氣干燥箱中，以140 ℃干熱滅菌2 h后于超凈臺(tái)中加入培養(yǎng)基，在31 ℃連續(xù)培養(yǎng)5 d，每天測(cè)定酶活力。在4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，并通過(guò)0.45 nm細(xì)菌濾器過(guò)濾，沉淀用無(wú)菌蒸餾水洗滌2 次，相同條件下離心去上清液，并重懸于等體積無(wú)菌蒸餾水，以二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法對(duì)發(fā)酵液上清液、沉淀以及未離心全菌液進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.3.3 生淀粉酶活力測(cè)定

參照Velikova等[21]的方法測(cè)定酶活力。以可溶性淀粉為底物，利用0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的生淀粉懸液。首先在250 mL三角瓶中加入19 mL底物，于搖床培養(yǎng)箱中40 ℃預(yù)熱10 min，之后加入5 mL粗酶液，40 ℃、140 r/min恒溫振蕩1 h后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH溶液終止反應(yīng)，取10 mL反應(yīng)液于 5 000 r/min離心5 min，取上清液利用DNS法OD520nm測(cè)定還原糖含量。

酶活力定義為在40 ℃、pH 6.0條件下，1 h水解生淀粉酶產(chǎn)生1 μmol還原糖（以麥芽糖計(jì)）所需的酶量。

1.3.4 產(chǎn)酶誘導(dǎo)性及穩(wěn)定性分析

以tMRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以淀粉、葡萄糖、淀粉和葡萄糖混合物為碳源，并以tMRS為空白對(duì)照31 ℃下進(jìn)行發(fā)酵，以24 h為一代次，進(jìn)行5 次連續(xù)傳代，分別測(cè)定去細(xì)胞上清液及菌體沉淀的酶活力，并將上清液、沉淀酶活力之和作為總酶活力進(jìn)行分析。

1.3.5 生淀粉酶的濃縮純化

取100 mL酶活力較高的菌液，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入硫酸銨至30%，過(guò)夜，將樣品離心，取上清液后加入硫酸銨至80%，充分沉降后，再次離心，取沉淀，加入等體積0.1 mol/L pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，置于透析袋中透析過(guò)夜，每2 h換一次水，用硫酸鋇檢測(cè)透析是否完全。將樣品置于截流量50 kDa的超濾管中，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，濃縮至1 mL，冷凍保存。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）及基于Native-PAGE的酶譜分析

SDS-PAGE根據(jù)Komatsu等[22]的方法，使用10%分離膠和5%濃縮膠。在β-巰基乙醇存在下，將10 μL上樣緩沖液混合40 μL蛋白質(zhì)溶液在100 ℃下加熱5 min，進(jìn)行變性。電泳條件為濃縮膠80 V、分離膠120 V，考馬斯染色檢測(cè)蛋白條帶。

根據(jù)Karim等[23]的方法并加以改進(jìn)，以Native-PAGE為基礎(chǔ)進(jìn)行酶譜分析，將蛋白質(zhì)溶液混合上樣緩沖液在70 ℃水浴4 min，然后進(jìn)行（分離膠中加入1%可溶性淀粉）。電泳結(jié)束后，將凝膠在0.1 mol/L pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的冷溶液中振蕩30 min。將凝膠用水漂洗并置于0.3% I2、3% KI中染色5 min，然后將凝膠置于0.1 mol/L pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，直到從深藍(lán)色背景中可以看到亮帶。與SDS-PAGE不同的是，Native-PAGE的電泳液及上樣緩沖液中，均不含SDS和 β-巰基乙醇，且電泳電壓為濃縮膠60 V、分離膠100 V，電泳過(guò)程中冰浴，防止蛋白變性。

1.3.7 不同來(lái)源生淀粉對(duì)L1產(chǎn)酶活力分析

以tMRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，甘薯生淀粉、綠豆生淀粉、玉米生淀粉、可溶性淀粉于熱空氣干燥箱中140 ℃干熱滅菌2 h，無(wú)菌條件下分別加入tMRS培養(yǎng)基中，L1菌液以4%接種量分別接入培養(yǎng)基中，在31 ℃培養(yǎng)48 h后，以1.3.3節(jié)方法測(cè)定淀粉上清液及沉淀酶活力，并對(duì)總酶活力進(jìn)行分析。

1.3.8 副干酪乳桿菌L1產(chǎn)酶單因素試驗(yàn)

淀粉占混合碳源（葡萄糖＋淀粉）的比例50%、碳源添加量2%、接種量4%、培養(yǎng)基初始pH 6.0、培養(yǎng)溫度35 ℃為單因素試驗(yàn)固定條件，以淀粉酶活力為指標(biāo)，選擇淀粉占碳源比例（50%、60%、70%、80%、90%）、碳源添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、培養(yǎng)基初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、培養(yǎng)溫度（20、25、30、35、40 ℃）5 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并選出3 個(gè)對(duì)總酶活力影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.3.9 乳酸菌產(chǎn)酶條件響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定產(chǎn)酶影響顯著且有意義的因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳的產(chǎn)酶條件。

1.3.10 代謝產(chǎn)物分析

1.3.10.1 L1淀粉水解產(chǎn)物變化情況

利用高效液相色譜測(cè)定葡萄糖與淀粉混合碳源、以淀粉為碳源的2 個(gè)實(shí)驗(yàn)組在48 h內(nèi)的發(fā)酵液中，葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖含量及變化情況。色譜柱：Waters Spherisorb NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm），色譜檢測(cè)條件：檢測(cè)器為RID示差檢測(cè)器，流動(dòng)相（乙腈∶水=75∶25，V/V），進(jìn)樣量20 μL，流速0.8 mL/min。

1.3.10.2 L1水解淀粉過(guò)程中產(chǎn)酸情況

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的最優(yōu)產(chǎn)酶條件，利用高效液相色譜測(cè)定無(wú)碳源、葡萄糖與淀粉的混合碳源、以淀粉為碳源以及葡萄糖為碳源的4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組在48 h內(nèi)的發(fā)酵液中乳酸、乙酸、檸檬酸、草酸、酒石酸的含量及變化情況。色譜柱：Cosmosil C18-PAQ（250 mm×4.6 mm，5 μL），色譜檢測(cè)條件：流動(dòng)相（pH 2.0，磷酸∶乙腈= 98∶2，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件中的One-Way ANOVA、Design-Expert V8.0.6響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以±s表示；采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 L1產(chǎn)酶位置分析

表1 L1產(chǎn)酶位置分析Table 1 Amylase activity in the fermentation broth of L1 and centrifugal supernatant and precipitate

由表1可以看出，L1具有利用淀粉的能力，但不同位置酶活力差異顯著（P＜0.05）。去細(xì)胞上清液、菌體沉淀以及未離心的全菌液均檢測(cè)到淀粉酶活力，上清液中檢測(cè)出較高的淀粉酶活力，在培養(yǎng)第1天檢測(cè)出最高酶活力為（28.35±0.45）U/mL；菌體沉淀檢測(cè)出的酶活力顯著低于去細(xì)胞上清液（P＜0.05），在第3天檢測(cè)出最高酶活力為（16.46±0.37）U/mL，且5 d內(nèi)，去細(xì)胞上清液的酶活力均顯著高于菌體沉淀（P＜0.05），由此可以看出，L1對(duì)淀粉的水解利用是胞外淀粉酶及菌體細(xì)胞表面淀粉酶共同作用的結(jié)果，并以去細(xì)胞上清液中的胞外淀粉酶占主導(dǎo)。不同的淀粉酶在淀粉顆粒上表現(xiàn)出不同的降解模式，包括離心水解和向心水解，通常α-淀粉酶比β-淀粉酶更有效[20]，這種復(fù)雜的酶水解系統(tǒng)使L1可能具有更復(fù)雜的淀粉水解模式。

與去細(xì)胞上清液、菌體沉淀的酶活力相比，未離心的全菌液酶活力顯著低于上清液及沉淀酶活力，可能的原因是，測(cè)定酶活孵育底物過(guò)程中，未離心的菌液具有滿足細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源、無(wú)機(jī)鹽等，而酶解出的還原糖為菌體生長(zhǎng)提供碳源，被細(xì)菌所利用，導(dǎo)致檢測(cè)出酶活較低。

2.2 L1產(chǎn)酶的誘導(dǎo)性

表2 L1產(chǎn)酶誘導(dǎo)性及產(chǎn)酶穩(wěn)定性分析Table 2 Induction and stability analysis of amylase production by L1

如表2所示，L1在4 種培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5 次，記錄每一代產(chǎn)酶情況，并對(duì)產(chǎn)酶誘導(dǎo)性及穩(wěn)定性進(jìn)行分析。tMRS與tMRS＋淀粉組以及tMRS＋葡萄糖與tMRS＋葡萄糖＋淀粉組相比，添加淀粉組的酶活力均顯著高于不添加淀粉組（P＜0.05），且不同代次，這種現(xiàn)象均顯著 （P＜0.05），說(shuō)明添加淀粉可以誘導(dǎo)L1分泌產(chǎn)生淀粉酶，且這種誘導(dǎo)性穩(wěn)定。這與大多數(shù)的淀粉分解乳酸菌（amylolytic lactic acid bacteria，ALAB）類似，在對(duì)ALAB的全基因組研究中，發(fā)現(xiàn)許多乳酸菌都含有負(fù)責(zé)水解淀粉的染色體，但只有被迫在淀粉環(huán)境中生存的菌株才能顯示出這些遺傳特征[24]。

通過(guò)對(duì)比添加淀粉為碳源的tMRS培養(yǎng)基中的酶活力（tMRS＋淀粉）及添加以葡萄糖和淀粉混合物為碳源的tMRS（tMRS＋葡萄糖＋淀粉）中酶活力，發(fā)現(xiàn)2 種培養(yǎng)基中淀粉存在的同時(shí)，葡萄糖的存在使tMRS＋葡萄糖＋淀粉組的酶活力顯著增加，檢測(cè)出了最大酶活力為（177.75±0.75）U/mL，與同代次的tMRS＋淀粉組的酶活力相比差異顯著（P＜0.05），最大酶活力為（67.52±0.57）U/mL。可能的原因是葡萄糖作為更易利用的碳源，促使乳酸菌迅速生長(zhǎng)，菌數(shù)的增加導(dǎo)致了酶活力的增加。Goh等[25]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖的存在也可能會(huì)與同為碳源的淀粉形成競(jìng)爭(zhēng)抑制，過(guò)量的葡萄糖可能會(huì)抑制部分淀粉酶的表達(dá)，因此尋找葡萄糖與淀粉的最適比例尤為重要。

2.3 SDS-PAGE及酶譜分析

對(duì)初步純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE及酶譜分析，在變性條件和非變性條件下均顯示出了單一條帶，說(shuō)明為同一蛋白。圖1A顯示出該生淀粉酶的估計(jì)分子質(zhì)量為105 kDa。該分子質(zhì)量在其他ALAB產(chǎn)的淀粉酶分子質(zhì)量范圍內(nèi)，如植物乳桿菌A6的分子質(zhì)量為135 kDa[26]、木薯乳桿菌LMG18010的分子質(zhì)量為140 kDa[27]。經(jīng)碘染后，如圖1B所示，深藍(lán)色凝膠背景下出現(xiàn)一條淺色透明條帶，說(shuō)明該位置的淀粉被水解，成功純化出了生淀粉酶。

圖1 生淀粉酶的SDS-PAGE（A）及酶譜（B）Fig. 1 SDS-PAGE (A) and zymogram (B) of raw starch-degrading amylase

2.4 不同來(lái)源生淀粉對(duì)L1產(chǎn)酶的影響

圖2 不同來(lái)源生淀粉對(duì)產(chǎn)酶活力的影響Fig. 2 Effect of raw starch from different sources on raw starchdegrading amylase activity

由圖2可知，L1對(duì)4 種不同來(lái)源生淀粉均具有水解利用能力。以不同來(lái)源淀粉為碳源的4 組，總酶活力均顯著高于未加碳源組的酶活力（P＜0.05），說(shuō)明L1具有利用這4 種不同來(lái)源生淀粉的能力。可溶性淀粉組去細(xì)胞上清液酶活力為（29.193±0.30）U/mL，菌體沉淀的酶活力為（17.023±0.96）U/mL，其總酶活力顯著高于其他各組（P＜0.05）。甘薯淀粉組和綠豆淀粉組差異不顯著，總酶活力分別為（19.05±0.53）、（19.38± 0.43）U/mL，但均顯著高于玉米淀粉組（13.25± 0.29）U/mL（P＜0.05）。造成這種結(jié)果的因素有很多，淀粉顆粒的大小、淀粉的結(jié)晶程度、顆粒的形狀、磷含量以及直鏈、支鏈淀粉的比例等[28]，由于甘薯、綠豆、玉米淀粉的顆粒大小，結(jié)晶程度，直鏈、支鏈淀粉占碳源比例無(wú)法統(tǒng)一，為了下一步產(chǎn)酶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性，故選擇產(chǎn)淀粉酶活力最高，產(chǎn)酶最穩(wěn)定的可溶性淀粉為碳源。

2.5 L1產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖3 5 種因素對(duì)L1產(chǎn)淀粉酶的影響Fig. 3 Effects of initial medium pH, starch proportion in total carbon source, carbon source concentration, culture temperature and inoculum amount on amylase production by L. paracasei L1

如圖3所示，初始pH 6.5、淀粉占碳源比例70%、碳源添加量2%、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量4%時(shí)酶活力最高，由于初始pH值、淀粉占碳源比例、碳源添加量對(duì)淀粉酶活影響較大，因此選擇此3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.5.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental values

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)基初始pH值、淀粉占碳源比例及碳源添加量3 個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.3 模型方差分析及響應(yīng)面分析

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

由表4 可以看出， 響應(yīng)面模型影響極顯著 （P＜0.01），而失擬項(xiàng)影響不顯著（P=0.760 3＞0.05），說(shuō)明該回歸模型實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合度高，適用于對(duì)酶活優(yōu)化的分析預(yù)測(cè)?；貧w系數(shù)R2為0.999 5，模型校正決定系數(shù)R2Adj為0.998 8，表明因變量與試驗(yàn)考察的自變量間線性關(guān)系顯著，數(shù)據(jù)誤差較小，結(jié)果可信。該模型的A、C、AB、AC、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），考慮顯著項(xiàng)，得到回歸模型方程：Y=188.52＋3.67A-0.59B＋11.47C-12.47AB-11.68AC-1.44BC-17.72A2-45.66B2-108.38C2。方程中，一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值決定了該模型中各個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響的主次順序，因此，各因素影響排序?yàn)椋禾荚刺砑恿浚镜矸壅继荚幢壤境跏紁H值。各因素交互作用響應(yīng)面見(jiàn)圖4。

圖4 各因素交互作用對(duì)生淀粉酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on the activity of raw starch-degrading amylase

2.5.4 產(chǎn)酶最佳條件確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

使用Design-Expert 8.0.6得到模型極值點(diǎn)，pH 6.5、淀粉占碳源68%、碳源添加量2.03%條件下，酶活力最高為193.83 U/mL，以此結(jié)果進(jìn)行了3 次重復(fù)獨(dú)立驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的酶活力平均值為（191.64±0.63）U/mL，是理論回歸預(yù)測(cè)值的98.87%，說(shuō)明該模型理論值與實(shí)際情況擬合度良好，適用于L1產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。

2.6 L1利用淀粉代謝產(chǎn)物分析

2.6.1 L1水解淀粉產(chǎn)物變化分析

通過(guò)對(duì)L1在48 h利用淀粉的水解產(chǎn)物分析，檢測(cè)其水解產(chǎn)物在不同時(shí)間的變化情況，對(duì)L1的淀粉代謝途徑進(jìn)行初步分析。

如圖5A所示，L1以淀粉為碳源代謝過(guò)程中，產(chǎn)生了葡萄糖、麥芽糖，以及不同聚合度的麥芽低聚糖。0～6 h水解初始階段，葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖質(zhì)量濃度迅速上升，分別達(dá)到（0.52±0.01）、（2.47±0.03）、（1.51±0.35）mg/mL；6 h后，麥芽三糖含量逐漸減少，葡萄糖及麥芽糖含量增加，并于20 h時(shí)達(dá)到峰值，質(zhì)量濃度分別為（1.02±0.03）、（2.99±0.64）mg/mL。20 h后，葡萄糖、麥芽糖質(zhì)量濃度緩慢減小，而麥芽三糖被大量消耗。而在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，只檢測(cè)到了低質(zhì)量濃度的麥芽四糖，這與Kanpiengjai等[29]研究的淀粉酶水解淀粉的代謝產(chǎn)物種類類似。

如圖5B所示，當(dāng)L1代謝混合碳源初期，易于被菌體代謝的單糖首先被利用，抑制了麥芽糖及麥芽低聚糖的產(chǎn)生，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，麥芽糖及麥芽三糖含量增加，10 h時(shí)達(dá)到峰值，質(zhì)量濃度分別為（4.15±0.43）、（1.79±0.11）mg/mL。且在生長(zhǎng)過(guò)程中，麥芽糖及麥芽三糖濃度出現(xiàn)短暫上升趨勢(shì)，這可能是淀粉酶水解的結(jié)果。

盡管混合碳源中存在菌體更易代謝的單糖，淀粉的水解作用依然存在。但容易代謝的單糖被優(yōu)先代謝至一定質(zhì)量濃度后，淀粉水解作用才開(kāi)始，從圖5可以看出，B組中麥芽糖和麥芽三糖出現(xiàn)時(shí)間與A組相比出現(xiàn)了延后。葡萄糖的存在沒(méi)有影響淀粉水解產(chǎn)物種類，這種淀粉水解代謝情況的可能作用途徑為：來(lái)源L1的淀粉酶首先將淀粉顆粒水解為大量麥芽糖和麥芽三糖，葡萄糖由麥芽糖或麥芽三糖水解而來(lái)，但葡萄糖是由麥芽三糖一步水解而來(lái)，還是通過(guò)麥芽糖這一中間產(chǎn)物代謝而來(lái)，就此問(wèn)題討論大致分為兩個(gè)觀點(diǎn)。Busch等[30]研究結(jié)果表明，麥芽三糖可同時(shí)水解出麥芽糖和葡萄糖，與大部分文獻(xiàn)報(bào)道中淀粉酶水解淀粉反應(yīng)類似。Suganuma等[31]研究提出，麥芽三糖作為催化劑，促進(jìn)麥芽糖基轉(zhuǎn)移，從而降解麥芽糖生成葡萄糖。L1水解淀粉的淀粉酶種類將作為下一步的研究?jī)?nèi)容，進(jìn)一步探究L1代謝生淀粉的機(jī)制。

圖5 副干酪乳桿菌L1碳水化合物變化分析Fig. 5 Changes in carbohydrates during fermentation of L. paracasei L1

2.6.2 L1代謝淀粉產(chǎn)酸分析

大多數(shù)乳酸菌產(chǎn)乳酸的同時(shí)，還有乙酸的產(chǎn)生，部分還產(chǎn)生甲酸、檸檬酸及琥珀酸[32-33]。在L1代謝過(guò)程中，未檢測(cè)出乙酸，屬于同型發(fā)酵菌株，草酸、酒石酸含量微少，且質(zhì)量濃度在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中基本保持不變。

如圖6所示，與空白組相比，以淀粉組乳酸產(chǎn)量增加顯著（P＜0.05），12 h后乳酸含量趨于穩(wěn)定，第20小時(shí)乳酸質(zhì)量濃度達(dá)到最大值（14.32±0.43）mg/mL，與江楊娟等[34]研究的乳酸菌代謝大豆糖蜜生產(chǎn)乳酸的最高產(chǎn)量12.18 mg/mL接近，說(shuō)明L1在以淀粉為單一碳源的條件下，也具有較高的產(chǎn)乳酸能力。

圖6 副干酪乳桿菌L1產(chǎn)酸分析Fig. 6 Analysis of acid production during fermentation of L. paracasei L1

混合碳源組與淀粉組相比，L1生長(zhǎng)前期產(chǎn)乳酸速率更高，可能的原因是，葡萄糖的存在縮短了L1的遲緩期，更快的到達(dá)對(duì)數(shù)期，菌數(shù)的增加導(dǎo)致產(chǎn)酶量增加，在這兩因素的共同作用下，產(chǎn)酸量顯著增加，第20小時(shí)乳酸質(zhì)量濃度達(dá)到峰值為（21.45±0.20）mg/mL。 葡萄糖為碳源組與混合碳源組相比，盡管乳酸質(zhì)量濃度最高為（32.42±0.76）mg/mL，但混合碳源組的葡萄糖添加量?jī)H為32%，盡管以生淀粉為碳源略微降低了乳酸的產(chǎn)量，但由于生淀粉的廉價(jià)且不需要進(jìn)行預(yù)處理，這種碳源顯示出了更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在一步法生產(chǎn)乳酸的工藝中有著重要意義。

綜上所述，在生淀粉基質(zhì)中，L1具有較好的產(chǎn)乳酸能力，在混合碳源中產(chǎn)酸，表現(xiàn)出了高效、高產(chǎn)的特點(diǎn)，是利用生淀粉一步法生產(chǎn)乳酸的潛力菌株。同時(shí)，同型發(fā)酵的特點(diǎn)也使其在食品發(fā)酵生產(chǎn)中有著更好的感官評(píng)價(jià)。

3 結(jié) 論

在對(duì)L1代謝生淀粉的研究中，發(fā)現(xiàn)L1在特異性結(jié)合淀粉的同時(shí)，水解并利用生淀粉來(lái)維持其生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，生淀粉酶存在于菌體表面及上清液。生淀粉可以誘導(dǎo)L1分泌淀粉酶，該酶對(duì)不同來(lái)源的生淀粉均有代謝能力，純化后檢測(cè)其分子質(zhì)量估計(jì)值為105 kDa，對(duì)培養(yǎng)條件優(yōu)化后酶活力可達(dá)到（193.83±0.63）U/mL。淀粉水解產(chǎn)物中的碳水化合物以葡萄糖、麥芽糖為終產(chǎn)物，麥芽低聚糖為中間產(chǎn)物，碳源中引入葡萄糖后，顯示出了葡萄糖優(yōu)先利用，淀粉次級(jí)利用的模式；L1具有較強(qiáng)的產(chǎn)乳酸能力，在混合碳源中，乳酸質(zhì)量濃度最高可達(dá)（21.45±0.20）mg/mL，表現(xiàn)出高效、高產(chǎn)的特點(diǎn)，以生淀粉為碳源大大降低了成本，對(duì)乳酸菌在淀粉類基質(zhì)中的應(yīng)用有著重要意義，同時(shí)從代謝角度證明了副干酪乳桿菌L1有代謝生淀粉的能力。