鰻魚骨膠原肽鈣螯合物的制備及其穩(wěn)定性和Caco-2吸收特性

錢躍威，徐瀚麟，呂奇晏，陳智超，滕 慧，陳 雷

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

鈣是與骨骼健康、血液凝結(jié)、神經(jīng)傳導(dǎo)和肌肉收縮相關(guān)的重要微量營(yíng)養(yǎng)元素，占體質(zhì)量的1.5%～2.2%[1-2]。鈣缺乏會(huì)引起骨質(zhì)疏松癥，甚至導(dǎo)致高血壓、腎結(jié)石和結(jié)腸癌等疾病[3]。這些缺陷可以通過(guò)攝入一些營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品緩解，例如牛奶、大豆分離蛋白、骨頭等[4]。于是市場(chǎng)上出現(xiàn)第1代鈣補(bǔ)充劑無(wú)機(jī)鈣，包括氯化鈣和碳酸鈣，長(zhǎng)期以來(lái)一直是人體的鈣補(bǔ)充劑。然而該類補(bǔ)充劑鈣含量較高，容易被胃酸吸收和消耗較多，未消化的部分容易留在腎臟中，導(dǎo)致造成腎結(jié)石或直接排泄，從而吸收率低[5]。第2代是有機(jī)酸鈣，例如乳酸鈣、乙酸鈣和葡萄糖酸鈣等，它們以離子鈣形式存在，吸收過(guò)程中的影響因素很多，并且有一定的毒性和副作用，例如乙酸鈣的急性毒性（半數(shù)致死量LD50＜5 g/kg），同時(shí)可能導(dǎo)致腎結(jié)石、心臟痙攣和死亡、血管鈣化和軟組織鈣化[6]。氨基酸螯合鈣中的鈣元素嵌合在各氨基酸分子之間，不會(huì)與食物中的植酸、草酸、胃酸和堿性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而影響人體吸收。氨基酸螯合的鈣直接通過(guò)腸黏膜吸收，可增加其生物利用度[7]。然而，過(guò)量攝入氨基酸會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)負(fù)氮平衡，從而影響人體的生理功能并導(dǎo)致各種不良后果[8]。與氨基酸相比，Plastein反應(yīng)提供了一種可能的方法，以合成具有所需生物利用度，安全性和功能特性的多功能肽基成分[9]。肽螯合鈣具有較高的溶解度，在弱堿性環(huán)境中胃腸道pH值為7.2時(shí)具有良好的穩(wěn)定性，可以有效地轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子并通過(guò)腸上皮細(xì)胞進(jìn)行吸收和利用，且吸收不易受食品成分的影響進(jìn)而增加了鈣的生物利用效率[10]。因此，肽鈣螯合物可能更適合于膳食鈣補(bǔ)充劑，以增強(qiáng)鈣的元素在人體中的消化吸收。

近年來(lái)，大多數(shù)研究人員致力于生產(chǎn)食物蛋白衍生的鈣結(jié)合肽，這些肽可以形成可溶性肽鈣復(fù)合物并促進(jìn)鈣的利用。目前，許多研究已從高蛋白植物、水生生物和植物中發(fā)現(xiàn)并鑒定了幾種具有鈣結(jié)合能力的肽，包括金耳木耳蛋白水解物[11]、脫鹽鴨蛋清肽[12]、磷酸肽[13]和章魚[14]等研究。肽的鈣結(jié)合活性取決于蛋白酶的類型、蛋白水解程度、肽分子質(zhì)量、氨基酸組成和特定氨基酸的含量[15]。此外，某些合成工藝的條件也會(huì)影響肽螯合鈣的活性，例如肽與鈣質(zhì)量比、pH值和溫度。

歐洲鰻魚骨約占活鰻魚質(zhì)量的10%，是鰻魚生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)品[16]。有報(bào)道表明源自魚骨的肽對(duì)鈣螯合能力較高[17]，并可以改善鈣的吸收和生物活性[18]。鰻魚骨因其低成本、高蛋白含量、高無(wú)機(jī)鹽和高可用性而有望成為鈣結(jié)合肽的良好來(lái)源。目前，鰻魚骨肽的生物活性鮮見(jiàn)報(bào)道。魚骨是鰻魚加工的副產(chǎn)品，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和利用價(jià)值，但現(xiàn)僅用于制造低附加值的產(chǎn)品，例如骨膠、動(dòng)物飼料或手工藝品。因此，本研究的主要目的是從鰻魚骨蛋白中優(yōu)化鈣結(jié)合肽，并評(píng)估針對(duì)水溶性鈣的體外結(jié)合特性。該發(fā)現(xiàn)對(duì)于利用鰻魚骨中的肽作為功能性補(bǔ)品中的生物活性肽成分將有很大幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福建農(nóng)林大學(xué)（福州）當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)的歐洲鰻魚（安圭拉鰻魚）骨，在-20 ℃保存直至使用。

胃蛋白酶（≥250 U/mg）、胰蛋白酶（≥250 U/mg）、 堿性蛋白酶（alkaline phosphatase，AKP）活性檢測(cè)試劑盒 北京索拉寶生物科技有限公司；胰凝乳蛋白酶（≥800 U/mg） 上海麥克林生物化學(xué)技術(shù)有限公司。其他化學(xué)藥品和試劑均為分析純。蛋白酶活性（U）的一個(gè)單位定義為在40 ℃可從指定濃度釋放1 μg酪氨酸的酶量。

1.2 儀器與設(shè)備

200SXV紅外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo-Nicolet 公司；RF-5301熒光光譜儀、AA6300C原子吸收分光光 度計(jì) 日本Shimadzu公司；Nova NanoSEM 230掃描電子顯微鏡 捷克Fei Czech Republic S.R.O.公司。

1.3 方法

1.3.1 鰻魚骨酶解

將準(zhǔn)備好的骨頭浸入5 g/100 mL NaOH溶液中1 h以去除附著的魚肉，其魚骨與5 g/100 mL NaOH溶液之比為1∶2（g/mL），殘留物用冷蒸餾水反復(fù)洗滌。將處理過(guò)的骨頭在60 ℃干燥6 h，然后粉碎成粉末。將底物鰻魚骨粉與蒸餾水按1∶8（g/mL）的比例混合，將混合物先用胃蛋白酶（37 ℃、pH 2.0）水解2 h，然后同時(shí)用胰蛋白酶（37 ℃、pH 7.0）和胰凝乳蛋白酶（37 ℃、pH 7.0）水解2 h，劑量為8 000 U/g（粉末質(zhì)量計(jì)）。水解后，將混合物在100 ℃加熱10 min以滅活酶。隨后，將混合物在4 ℃以7 830 r/min離心15 min，并收集上清液用于分析水解度、肽產(chǎn)率和鈣結(jié)合能力。凍干后，獲得歐洲鰻魚骨膠原肽（european eel bone collagen peptide，EBCP）。

1.3.2 從歐洲鰻魚骨中制備鈣結(jié)合肽

將EBCP溶解于去離子水中（5 mg/mL），然后以不同的質(zhì)量比（1∶2～5∶1）添加CaCl2。將混合物在水浴中于不同溫度（30～110 ℃）和pH 4.5～9.5孵化20～180 min。螯合反應(yīng)后，將無(wú)水乙醇（溶液體積的9 倍）添加到混合溶液中，以分離出螯合物。將混合物在4 ℃、7 830 r/min離心30 min，收集沉淀物，凍干即為鈣結(jié)合鰻魚骨膠原蛋白肽（european eel bone collagen peptide-calcium，EBCP-Ca）。

1.3.3 EBCP-Ca結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 熒光光譜分析

將0.05 mg/mL的EBCP溶解在適量的蒸餾水中，然后添加0、0.6、1.2、1.8、2.4 mg/mL和3.0 mg/mL的CaCl2，使EBCP通過(guò)與鈣離子反應(yīng)成為螯合物EBCP-Ca。 在室溫下，使用10 mm石英比色杯確定樣品的熒光光譜。熒光光譜條件如下：激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為320～450 nm，激發(fā)和發(fā)射縫隙寬度分別為10 nm和15 nm，采樣間隔為1 nm。

1.3.3.2 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）分析

EBCP-Ca的二級(jí)結(jié)構(gòu)在室溫下進(jìn)一步用紅外分光光度計(jì)表征，其波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。樣品制備步驟如下：將1 mg EBCP或EBCP-Ca復(fù)合物與100 mg干燥KBr混合，研成細(xì)粉，用于制備透明KBr片劑。

1.3.3.3 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）分析

將EBCP和EBCP-Ca粉末的微結(jié)構(gòu)噴涂并鍍金，SEM在15 kV的加速電壓下觀察樣品。

1.3.4 EBCP-Ca的穩(wěn)定性

EBCP-Ca對(duì)溫度、pH值和體外模擬消化的穩(wěn)定性基于Wu Wenmin等[19]的方法并略作修改。將凍干的EBCP-Ca 溶解在去離子水中至終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，并將該溶液在不同溫度（30～110 ℃）加熱1 h。此外，溶液還應(yīng)在環(huán)境溫度和pH 2～12條件下孵育1 h。孵育后，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定溶液中的鈣離子含量。

模擬胃消化階段：將去離子水中的模擬胃液調(diào)節(jié)為pH 2.0，其中包括2 mg/mL NaCl、12 mmol/L HCl和3.2 mg/mL豬胃蛋白酶。將5.0 mg/mL EBCP-Ca與模擬胃液以1∶1的質(zhì)量比混合，然后調(diào)節(jié)至pH 2.0，并在37 ℃的恒溫下以100 r/min的轉(zhuǎn)速連續(xù)攪拌2 h，以模擬胃的消化，取上清液并用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。

模擬小腸消化階段：事先準(zhǔn)備模擬腸液，包含鹽溶液（110.1 mg CaCl2和328.05 mg/mL NaCl在3.0 mL去離子水中，pH 7.0）、膽汁鹽溶液（375.0 mg溶解于7.0 mL去離子水，pH 7.0）和酶溶液（120.0 mg脂肪酶在5.0 mL去離子水中，pH 7.0）。在胃消化結(jié)束時(shí)，將先前溶液的pH值（60.0 mL）升高至7.0，并將制備的模擬腸液添加至先前溶液，以使脂肪酶和5.0 mg/mL膽汁鹽的最終質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL。將混合物的pH值調(diào)節(jié)至7.0，然后在37 ℃、100 r/min連續(xù)搖動(dòng)培養(yǎng)2 h，收集并在冰水浴中冷卻，并在4 ℃、15 000 r/min離心30 min，取上清液并用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。其中穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中以EBCP-Ca未經(jīng)過(guò)處理的鈣保留率為對(duì)照。鈣保留率計(jì)算如式（1）所示：

式中：A1為添加消化液的鈣含量/mg；A2為不添加消化液的鈣含量/mg。

1.3.5 EBCP-Ca對(duì)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性

根據(jù)Zou Yaqun等[20]的方法，將Caco-2細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在膠原蛋白包被的96 孔板中，將其在37 ℃的恒溫CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。除去培養(yǎng)基后，將200 μL不同濃度的樣品添加到每個(gè)孔中，并為每個(gè)樣品準(zhǔn)備8～10 個(gè)平行孔。在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育20 h后，向每個(gè)孔中添加20 μL MTT（5 mg/mL），溫育4 h后，通過(guò)離心除去沉淀物。然后，向每個(gè)孔中加入150 μL DMSO，并以低速搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算 如式（2）所示：

式中：B0為沒(méi)有細(xì)胞的吸光度；B1為添加樣品的吸光度；B2為不加樣品的吸光度。

1.3.6 Caco-2細(xì)胞中的鈣吸收測(cè)定

鈣吸收實(shí)驗(yàn)基于Wu Haohao[21]和Makhov[22]等的方法修改。在體外構(gòu)建了腸道細(xì)胞模型，并進(jìn)行修改。將細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在12 孔板中。在前1 周每隔1 d更換一次培養(yǎng)基，并在第2周每天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)21 d后，獲得體外腸細(xì)胞模型。去除Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)基，用無(wú)鈣HBSS（Hank’s balanced salt solution）洗凈2 次，并在37 ℃預(yù)熱10 min，去除HBSS，加入不同濃度樣品，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時(shí)間。反應(yīng)后，在4 ℃用HBSS洗滌2 次以除去殘留的提取液，加入500 μL的體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100細(xì)胞裂解液，反復(fù)冷凍和融化以裂解細(xì)胞，然后超聲處理10 min，得到細(xì)胞懸液。一部分用BCA（bicinchoninic acid）蛋白濃度試劑盒測(cè)量總蛋白質(zhì)量濃度（g/L），從細(xì)胞懸液中取出另一部分，15 000 r/min離心10 min，通過(guò)原子吸收分光光度計(jì)確定溶液中的鈣離子含量和AKP活性檢測(cè)試劑盒確定AKP活性。實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組為只加入培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)，CaCl2組為加入4 mg/mL CaCl2溶液的細(xì)胞培養(yǎng)，模型組為加入無(wú)鈣HBSS的細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞攝取率計(jì)算如下：

式中：C1為細(xì)胞內(nèi)的鈣離子質(zhì)量濃度/（mg/L）；C2為細(xì)胞總蛋白質(zhì)量濃度/（g/L）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶工藝對(duì)歐洲鰻魚骨水解的影響

人體攝入食物中的蛋白質(zhì)在胃液消化酶的作用下，初步水解，在小腸中完成整個(gè)消化吸收過(guò)程，而人體消化蛋白系統(tǒng)主要是由胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用在蛋白質(zhì)的肽鍵上，分解為肽或氨基酸。 表1為單酶處理和包含2 種或3 種酶的組合處理的比較。在三酶處理中，魚骨粉與蒸餾水料液比1∶8（g/mL）、酶劑量8 000 U/g。雙酶同時(shí)水解（同時(shí)添加胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）中兩種酶的添加比例為1∶1（酶活性比），雙酶同時(shí)水解中2 種酶的水解時(shí)間比例為1∶1（首先用胃蛋白酶水解底物，然后用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶水解，或者3 種酶同時(shí)進(jìn)行水解），發(fā)現(xiàn)3 種酶的協(xié)同作用顯著改善了由單酶或雙酶產(chǎn)生肽的鈣結(jié)合能力，肽的最佳鈣螯合率為35.78%。此外，3 種酶協(xié)同作用后蛋白質(zhì)的肽鍵逐漸斷裂，分解成肽和氨基酸，導(dǎo)致水解物的水解度和肽產(chǎn)量顯著提高（P＜0.05）。研究最佳水解條件如下：魚骨粉與蒸餾水料液比為1∶8（g/mL），酶劑量為24 000 U/g （胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均為8 000 U/g），分別在37 ℃和不同pH值環(huán)境下放置4 h。

表1 3 種蛋白酶相互作用的比較Table 1 Comparison of three single proteases and their combinations used for eel bone hydrolysis

2.2 工藝條件對(duì)EBCP-Ca螯合率的影響

圖1 多肽與鈣質(zhì)量比（A）、溫度（B）、時(shí)間（C）和pH值（D）對(duì)鈣結(jié)合能力的影響Fig. 1 Effects of mass ratio of peptide to calcium (A), temperature (B), times (C) and pH (D) on calcium-binding capacity

鈣結(jié)合能力隨質(zhì)量比的不同而變化（圖1A）。當(dāng)多肽與鈣質(zhì)量比從1∶2增加到5∶1時(shí)，鈣結(jié)合能力從42.65%顯著增加到84.01%（P＜0.05）。圖1B表明，隨著溫度的升高，鈣的螯合速率逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)，結(jié)合能力最高，再隨著溫度的升高，螯合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差，與鈣離子的結(jié)合能力逐漸變低。當(dāng)螯合時(shí)間從20 min延長(zhǎng)到60 min時(shí)，螯合率從77.63%增加到82.71%（圖1C），并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)到180 min無(wú)顯著差異（P＞0.05），這表明肽與鈣的螯合反應(yīng)快，類似于乳清太平洋鱈魚與鈣的結(jié)合[23]。當(dāng)pH值從4.5增加到7.5時(shí)，鈣結(jié)合能力逐漸增加，并且在pH 7.5時(shí)達(dá)到最大值 （圖1D）。這可能是由于pH值和OH-的增加，而H＋和OH-達(dá)到了一定的平衡，從而增強(qiáng)了鈣離子和NH4＋， —OH和—COOH之間的配位作用[24]。

2.3 熒光光譜測(cè)定結(jié)果

圖2 EBCP和EBCP-Ca的熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of EBCP and EBCP-Ca

芳香氨基酸，例如苯丙氨酸和色氨酸可以在特定的激發(fā)波長(zhǎng)下產(chǎn)生內(nèi)源性熒光。因此，波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度的變化可有效反映有機(jī)配體基團(tuán)與金屬離子之間的相互作用（圖2）。隨著CaCl2質(zhì)量濃度的增加，在約310 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度先增加然后減少。熒光強(qiáng)度在約360 nm波長(zhǎng)處顯著增加，吸收峰從356 nm移至360 nm，結(jié)果表明鈣離子可能與芳香族氨基酸螯合，導(dǎo)致熒光變化。但添加150 μmol鈣離子以上出現(xiàn)熒光降低，而Cai Xixi等[25]報(bào)道了相同的結(jié)果，即特定二肽（Phe-Tyr）的內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨著鈣離子濃度的增加而降低（熒光猝滅），結(jié)果表明鈣離子的添加 引起鰻魚多肽的折疊和結(jié)構(gòu)變化，反應(yīng)產(chǎn)生了EBCP-Ca。另一個(gè)可能的解釋是鰻魚骨多肽中的發(fā)色團(tuán)與鈣離子反應(yīng)，從而改變了激發(fā)態(tài)的能量并導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[26]。

2.4 FTIR測(cè)定結(jié)果

圖3 EBCP和EBCP-Ca的FTIR Fig. 3 FTIR spectra of EBCP and EBCP-Ca

FTIR可以有效地區(qū)分兩種物質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)差異，光譜中酰胺和羧酸鹽吸收峰的變化可以反映光譜的坐標(biāo)[27]。EBCP和EBCP-Ca復(fù)合物的FTIR如圖3所示。波數(shù)3 377.29 cm-1吸收歸因于N—H膠原肽的拉伸振動(dòng)。螯合反應(yīng)后，能帶移至3 332.36 cm-1，表示肽中的電子云密度由于誘導(dǎo)效應(yīng)或偶極場(chǎng)效應(yīng)而變得更強(qiáng)，表明 —NH參與了螯合物的形成[28]。1 652.96 cm-1處的吸收帶對(duì)應(yīng)于與鈣螯合后不移動(dòng)的肽中的酰胺I帶，表明C＝O不參與鈣的共價(jià)鍵合反應(yīng)。1 446.58 cm-1和1 419.58 cm-1處的COO—譜帶轉(zhuǎn)移至1 448.51 cm-1和1 406.08 cm-1處，表明—COOH可能與鈣結(jié)合，并且這種類型的螯合劑可能是由于未結(jié)合的自由電子所致[29]。將1 249.85 cm-1和1 151.48 cm-1的條帶轉(zhuǎn)移到1 245.99 cm-1和1 159.20 cm-1， 它們屬于酰胺III，代表C—N的拉伸振動(dòng)和N—H的彎曲振動(dòng)。它主要來(lái)自甘氨酸和脯氨酸中的—CH2與鈣離子的結(jié)合[25]。另外，肽鈣螯合物在623.00 cm-1具有一個(gè)新的吸收峰，這在肽譜中不存在。很多研究表明，氨基酸殘基的羧基是金屬離子的主要結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)Bao Xiaolan等[30]報(bào)道，大豆蛋白水解物中鈣的結(jié)合水平隨羧基含量的增加而線性增加。這些結(jié)果證實(shí)鈣離子主要結(jié)合從鰻魚骨中提取的水解產(chǎn)物肽中的羧基氧原子和氨基氮原子部位。

2.5 SEM結(jié)果

SEM是透射電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡之間的微觀形態(tài)觀察方法，可以直接利用樣品表面材料的材料特性進(jìn)行顯微成像。圖4A、B分別顯示了EBCP和EBCP-Ca復(fù)合物的表面形態(tài)。EBCP顯示出整體的外觀和粗糙的表面（圖4A）。相比之下，EBCP-Ca表現(xiàn)出致密的顆粒狀結(jié)構(gòu)，并且大小分布密集，這與EBCP的外觀明顯不同 （圖4B）。金屬離子可以與肽相互作用，并且對(duì)肽螯合物有明顯的作用[31]。因此，鈣離子可以通過(guò)加速肽的二聚化和穩(wěn)定所得的二聚體促進(jìn)聚集。分子間力、表面張力和各向同性力的影響可能有助于聚集過(guò)程，而肽鏈中的巰基、羧基和氨基則通過(guò)水溶液中的分子間氫鍵形成“鹽橋”，從而改變了EBCP的性能[32]。此外，就脫水而言，肽鏈的氨基酸可與鋅離子結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；此后，添加到EBCP的鈣離子屏蔽了多肽鏈上的負(fù)電荷，形成了“鹽橋”并誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集[33]。形態(tài)分析結(jié)果表明，EBCP與鈣離子之間的強(qiáng)相互作用導(dǎo)致形成更緊密的連接顆粒。

圖4 EBCP和EBCP-Ca的SEMFig. 4 SEM images of EBCP and EBCP-Ca

2.6 EBCP-Ca的穩(wěn)定性

圖5 EBCP-Ca的穩(wěn)定性 Fig. 5 Stability of EBCP-Ca

EBCP-Ca 在特殊pH 值和溫度下的穩(wěn)定性如圖5A、B所示。在圖5A中，5 mg/mL EBCP-Ca處于不同pH值（2～12）溶液后，EBCP-Ca鈣保留率從對(duì)照組（99.08±0.92）%降低至（61.86±0.22）%。在強(qiáng)酸性條件下，鈣保留率明顯降低（P＜0.05）。據(jù)推測(cè)，高H＋濃度可在酸性條件下與鈣離子競(jìng)爭(zhēng)活性結(jié)合基團(tuán)，從而促進(jìn)肽鈣螯合物的解離，該發(fā)現(xiàn)與在酸性條件下較低的螯合速率一致；當(dāng)pH值偏向堿性時(shí)，大量的H＋減少而大量的OH－增加，不會(huì)與金屬離子競(jìng)爭(zhēng)活性結(jié)合基團(tuán)。在圖5B中，隨著溫度的升高，EBCP-Ca的鈣保留率略有下降，并且都保持在78%以上，不同組之間存在不顯著差異（P＞0.05），這表明螯合劑對(duì)熱處理具有一定的 抵抗力。

人類飲食中的營(yíng)養(yǎng)通常通過(guò)胃腸消化吸收到腸道，但是蛋白質(zhì)可能會(huì)被胃蛋白酶和脂肪酶等水解酶水解，形成較小的肽或氨基酸，并且該肽的生物學(xué)活性可能會(huì)完全改變。因此，生物活性物質(zhì)在體外模擬胃和小腸環(huán)境的耐受性可用于評(píng)估其消化穩(wěn)定性。EBCP-Ca在胃腸環(huán)境中的鈣保留率如圖5C所示。與模擬胃液水解0 h（pH 2，不添加胃蛋白酶）相比，添加胃蛋白酶時(shí)鈣保留率保持在82%左右，延長(zhǎng)的消化時(shí)間對(duì)鈣保留率沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。結(jié)果表明，模擬的胃液對(duì)螯合物的穩(wěn)定性影響很小，但對(duì)pH值敏感，并且在酸性條件下可使部分不穩(wěn)定的結(jié)合鈣解離成離子態(tài)。據(jù)報(bào)道，小分子質(zhì)量的肽對(duì)胃蛋白酶水解的敏感性降低[34]。胃消化后，將先前的胃液與模擬腸液相結(jié)合進(jìn)行二次消化。與0 h（pH 7.0、不添加脂肪酶）的模擬腸液相比，由于添加脂肪酶和隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，鈣保留率逐漸降低至（44.78±0.29）%，與對(duì)照組相比呈顯著差異 （P＜0.05）。可能胃消化環(huán)境導(dǎo)致EBCP-Ca某些結(jié)構(gòu)變化，從而影響其結(jié)合鈣離子的能力，此外，胰腺的存在可能導(dǎo)致肽結(jié)合能力下降。研究肽螯合鈣在人胃腸道中的環(huán)境穩(wěn)定性，因?yàn)殁}離子可能與植酸形成沉淀反應(yīng)，并將結(jié)合的鈣轉(zhuǎn)變?yōu)槲敢褐械挠坞x鈣，從而導(dǎo)致鈣生物利用度下降[35]。

2.7 EBCP-Ca對(duì)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性

圖6 EBCP-Ca細(xì)胞毒性Fig. 6 Cytotoxicity of EBCP-Ca

如圖6所示，0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL的EBCP-Ca作用于Caco-2細(xì)胞中沒(méi)有顯示出明顯的細(xì)胞毒性，且細(xì)胞存活率都在93%以上。當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度為0.312 5 mg/mL或更低質(zhì)量濃度時(shí)，在Caco-2細(xì)胞中未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，但當(dāng)質(zhì)量濃度為0.625 mg/mL以上時(shí)，則逐漸降低了Caco-2細(xì)胞的活力（P＜0.05），隨著加入量越大，對(duì)Caco-2細(xì)胞的存活率也就越低。

2.8 Caco-2細(xì)胞中AKP活性和鈣攝取率分析

檢測(cè)每組Caco-2細(xì)胞的AKP活性（圖7A、B）。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)箱中孵育后，細(xì)胞AKP活性會(huì)急劇下降，這表明空白組削弱了Caco-2細(xì)胞的活性，而Caco-2細(xì)胞的活性通常是物質(zhì)吸收和運(yùn)輸?shù)闹饕?。與對(duì)照組相比，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，模型組中Caco-2細(xì)胞的AKP活性顯著降低（P＜0.05）。然而，暴露于不同培育時(shí)間和EBCP-Ca質(zhì)量濃度的Caco-2細(xì)胞的AKP活性仍不低于正常組。鈣對(duì)照組的細(xì)胞與模型組有顯著差異（P＜0.05）。不同培養(yǎng)時(shí)間EBCP-Ca組對(duì)Caco-2細(xì)胞的AKP活性為（17.67±0.21）、（35.24±0.90）、（3 9.5 0±1.1 7）U/g 和（4 3.4 3±0.6 6）U/g， 而CaCl2組的AKP活性僅為（16.53±0.19）U/g，與對(duì)照組（（18.06±1.07）U/g）相比沒(méi)有顯著差異 （P＞0.05），這表明鈣對(duì)照組對(duì)Caco-2細(xì)胞的AKP活性沒(méi)有積極作用。相反，添加EBCP-Ca可以有效提高小腸細(xì)胞中AKP的活性水平，進(jìn)而維持小腸形成的活性，這有助于人類小腸消化吸收食物并增加AKP活性[36]。

研究Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)中加入不同質(zhì)量濃度EBCP-Ca組對(duì)細(xì)胞吸收鈣質(zhì)量濃度影響（圖7C）和加入3 mg/mL EBCP-Ca在培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞吸收鈣質(zhì)量濃度的變化（圖7D），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，模型組中Caco-2細(xì)胞的鈣質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05）。在圖7C中，第2小時(shí)和第4小時(shí)實(shí)驗(yàn)組的鈣質(zhì)量濃度超過(guò)正常水平（（0.42±0.00）mg/mL），分別達(dá)到（0.76±0.05）mg/mL 和（0.91±0.01）mg/mL，補(bǔ)充EBCP-Ca可以減少鈣的時(shí)間依賴性。在圖7D中，隨著EBCP-Ca質(zhì)量濃度逐漸增加，細(xì)胞鈣含量也增加，在Caco-2培養(yǎng)4 h后，樣品實(shí)驗(yàn)組的鈣質(zhì)量濃度均超過(guò)正常水平（（0.42±0.00）mg/mL）， 在細(xì)胞培養(yǎng)中補(bǔ)充EBCP-Ca劑量可以減少細(xì)胞對(duì)鈣的劑量依賴性[25]。相反，CaCl2組沒(méi)有顯示出優(yōu)異的保護(hù)功效。盡管CaCl2組遠(yuǎn)高于模型組中的鈣質(zhì)量濃度 （P＜0.05），但在2 h和4 h的所有不同質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)組中，與EBCP-Ca相比，鈣的保護(hù)作用仍存在較大差距失利。

圖7 EBCP-Ca補(bǔ)充劑對(duì)Caco-2細(xì)胞鈣含量和AKP活性的影響Fig. 7 Effects of EBCP-Ca concentration and culture time on the calcium content and AKP activity in Caco-2 cells

3 結(jié) 論

鰻魚骨通過(guò)單酶、雙酶和三酶結(jié)合水解，得到不同鈣結(jié)合能力、水解度和肽產(chǎn)量的水解液，選擇3 種酶協(xié)同作用后的水解液，其值分別為（35.78±0.13）%、（40.96±0.24）%和（32.86±0.19）%，把水解液與CaCl2結(jié)合得到EBCP-Ca，并優(yōu)化了鈣螯合物的制備條件，通過(guò)優(yōu)化確定EBCP-Ca的制備條件為40 ℃、pH 7.5、40 min、多肽與鈣質(zhì)量比5∶1，此時(shí)鈣螯合率為80%以上。熒光光譜、FTIR光譜和SEM結(jié)果表明，鈣離子可能與EBCP中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的氨基氮和羧酸基的氧原子相互作用形成EBCP-Ca，其結(jié)構(gòu)不同于EBCP，但是CaCl2過(guò)量會(huì)出現(xiàn)熒光猝滅。 EBCP-Ca可以在不同溫度、pH值和模擬胃腸消化條件下保持穩(wěn)定性，這可能有利于鈣的吸收。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，EBCP-Ca不會(huì)影響細(xì)胞的存活，而對(duì)照組CaCl2會(huì)影響細(xì)胞活性，加入量增加導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響增大，Caco-2細(xì)胞的存活率會(huì)顯著降低（P＜0.05）。另外，使用Caco-2細(xì)胞單層模型在體外證實(shí)了EBCP-Ca的鈣攝取率顯著高于模型組和對(duì)照組（P＜0.05），鈣離子與EBCP結(jié)合有助于細(xì)胞的吸收，效果優(yōu)于CaCl2組。研究鈣離子質(zhì)量濃度與Caco-2細(xì)胞在不同質(zhì)量濃度和時(shí)間下攝取的EBCP-Ca的AKP活性之間的關(guān)系，可以進(jìn)一步維持小腸形成的活性，從而有助于人類小腸消化吸收食物中蛋白質(zhì)，增加體內(nèi)的AKP活性。結(jié)果表明，制備EBCP-Ca作為鈣補(bǔ)充劑是提高鰻魚骨利用率，增加附加值的途徑之一。EBCP-Ca有利于促進(jìn)鈣吸收，作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品具有潛在開發(fā)價(jià)值。應(yīng)對(duì)鰻魚骨水解物進(jìn)行純化、鑒定活性鈣結(jié)合肽，以及促進(jìn)肽鈣螯合物吸收鈣的確切機(jī)理和肽鈣螯合物的體內(nèi)鈣吸收效率進(jìn)行進(jìn)一步研究。