鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控血管內(nèi)膜增生的研究進(jìn)展

高昆，劉紅霞，何朝勇,2

1中國藥科大學(xué)，南京210009；2天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

血管成形術(shù)可重塑血管管腔、恢復(fù)受斑塊阻塞>血管內(nèi)的血流通過、改善低灌注組織或器官內(nèi)的氧氣物質(zhì)供應(yīng)，是臨床治療動(dòng)粥斑塊積累的常規(guī)方法[1]。然而，由于手術(shù)導(dǎo)致的血管損傷或血流動(dòng)力學(xué)改變會(huì)引起血管內(nèi)膜增殖，導(dǎo)致血管二次狹窄，嚴(yán)重影響了血管成形術(shù)的治療效果和患者預(yù)后。研究數(shù)據(jù)顯示，冠脈植入裸露支架后1～3年內(nèi)發(fā)生再狹窄的概率為30.6%。藥物洗脫支架盡管可降低再狹窄率，但這類藥物抑制了內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的增殖和修復(fù)能力，導(dǎo)致術(shù)后晚期管腔丟失速度加快[2,3]。因此避免血管新生內(nèi)膜形成所導(dǎo)致的血管二次狹窄，對(duì)提高血管介入療法的治療效果具有重要意義。目前對(duì)于新生內(nèi)膜的形成機(jī)制尚不完全明確，通常認(rèn)為該過程可分為以下三個(gè)階段：①多種因素引起血管血流動(dòng)力學(xué)改變或血管內(nèi)皮損傷，致使ECs維持的血管穩(wěn)態(tài)失衡；②免疫細(xì)胞和血小板浸潤到損傷部位并釋放IL-8、PDGF等細(xì)胞因子；③異常升高的細(xì)胞因子激活位于血管中膜的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，VSMCs在多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的幫助下穿越內(nèi)彈性膜到內(nèi)膜下，大量增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，使得血管內(nèi)膜增厚[4,5]。KLFs家族是體內(nèi)廣泛分布的一類轉(zhuǎn)錄因子，在ECs、VSCMs、免疫細(xì)胞等部位中具有重要的生物調(diào)節(jié)功能，新生內(nèi)膜形成過程中存在多種KLFs因子的表達(dá)變化?，F(xiàn)就KLFs在血管內(nèi)膜增生中的作用闡述如下。

1 KLFs的結(jié)構(gòu)與功能

KLFs家族是一類結(jié)構(gòu)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，因結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄因子SP1相似，故又被稱為SP/KLF家族。該家族每個(gè)成員的羧基端都有三個(gè)高度保守的Cys2 /His2鋅指結(jié)構(gòu)域，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)都能與靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的5′-GACCC-3保守序列結(jié)合，調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)[6]。此外，有研究表明，KLFs的Cys2 /His2鋅指結(jié)構(gòu)域還能與核輸入因子β或β樣核輸入因子結(jié)合調(diào)控KLFs由胞質(zhì)向核內(nèi)的轉(zhuǎn)位[7]。盡管KLFs家族成員在結(jié)構(gòu)上高度保守，所識(shí)別的DNA序列亦存在一定程度重疊，但不同的KLFs對(duì)同一基因卻擁有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。這主要是由于某些KLFs蛋白的氨基端具有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域和轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域，能與轉(zhuǎn)錄輔激活物、轉(zhuǎn)錄輔阻遏物相結(jié)合調(diào)控KLFs的轉(zhuǎn)錄活性，如KLF3、KLF8、KLF12的氨基端存在CtBP蛋白結(jié)合位點(diǎn)，KLF10、KLF11等的氨基端具有Sin3蛋白結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)能與轉(zhuǎn)錄輔阻遏物CtBP或者Sin3蛋白結(jié)合，使KLFs由轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)變成抑制因子。這種調(diào)控方式使得不同KLFs之間存在相互調(diào)節(jié)、競(jìng)爭(zhēng)、協(xié)同的作用，KLFs在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能也因此變得更加多樣和復(fù)雜。

2 KLFs對(duì)血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)

ECs是構(gòu)成血管內(nèi)膜的重要成分，在正常生理狀態(tài)下，分泌NO及多種細(xì)胞因子調(diào)控血管張力、血管生長和凝血等生理功能。當(dāng)血流狀態(tài)改變或外力引起內(nèi)皮損傷后，ECs對(duì)中膜VSMCs的保護(hù)和調(diào)控遭到破壞，導(dǎo)致VSMCs暴露于炎癥因子和生長因子，引起VSMCs過度增殖和遷移形成新生內(nèi)膜。部分在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的KLFs如KLF2、KLF4、KLF6和KLF11可通過調(diào)節(jié)ECs中eNOS、IL-6、黏附分子的表達(dá)等途徑參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)膜穩(wěn)態(tài)[8,9]，并借此參與新生內(nèi)膜的形成過程。

2.1 KLF2和KLF4與血流動(dòng)力學(xué)變化 ECs是血管中直接與流動(dòng)的血液相接觸的細(xì)胞，其細(xì)胞膜上的機(jī)械力感受器能夠感知血流變化，并通過復(fù)雜的機(jī)械力信號(hào)傳導(dǎo)通路將機(jī)械信號(hào)傳遞到核內(nèi)，調(diào)節(jié)ECs內(nèi)的氧化應(yīng)激、細(xì)胞排列、脂蛋白滲透與氧化等過程。通常認(rèn)為高剪切力的單向?qū)恿?UF)具有保護(hù)ECs的作用，而低剪切力的湍流(DF)則會(huì)誘導(dǎo)ECs表達(dá)VCAM-1、E-selectin、MCP-1招募免疫細(xì)胞或釋放炎癥因子IL-6等激活中膜VSMCs。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某些外界因素引起血流由UF變?yōu)榈图羟辛ν牧鱀F時(shí)，ECs中的一些機(jī)械力敏感型轉(zhuǎn)錄因子如KLF2、KLF4會(huì)出現(xiàn)明顯的表達(dá)降低。研究發(fā)現(xiàn)，KLF2能調(diào)控血流動(dòng)力敏感蛋白PPAP2B的表達(dá)，介導(dǎo)層流下ECs的排列和抗炎作用[10]。CD39是ECs膜上一種具有動(dòng)脈粥樣硬化(AS)保護(hù)作用的蛋白，層流誘導(dǎo)的KLF2能在轉(zhuǎn)錄水平與CD39基因的啟動(dòng)子結(jié)合增加CD39表達(dá)，減少ApoE-/-小鼠的AS斑塊形成[8]。此外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示，在內(nèi)皮細(xì)胞中敲除KLF2和KLF4會(huì)損傷ECs內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凝血等過程[9]。上述結(jié)果提示，在血管靜脈瘺、靜脈旁路移植手術(shù)等引起血流狀態(tài)變化時(shí)，KLFs可能通過參與調(diào)節(jié)ECs對(duì)血流狀態(tài)變化的應(yīng)答參與新生內(nèi)膜形成。

2.2 KLF6與血管內(nèi)皮損傷修復(fù) KLFs抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的修復(fù)亦可能是其參與調(diào)節(jié)新生內(nèi)膜的形成的方式之一。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子KLF6能與MMP14的啟動(dòng)子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平增加MMP14的表達(dá)，而MMP14會(huì)通過水解內(nèi)皮糖蛋白釋放可溶性內(nèi)皮糖蛋白影響TGF-β信號(hào)通路，從而影響血管損傷后內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)[11]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)KLF6還可與SP1、Smad3組成三元復(fù)合物，該復(fù)合物能與Ⅰ型TGF-β受體ALK-1的啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)ALK-1的表達(dá)，從而影響TGF-β信號(hào)通路，間接參與TGF-β信號(hào)通路介導(dǎo)的ECs損傷后修復(fù)過程[12]。

3 KLFs 對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控

內(nèi)皮損傷后，ECs招募白細(xì)胞在損傷局部浸潤，并釋放炎癥因子是引起VSMCs激活的重要原因之一。KLFs能通過多種途徑參與對(duì)ECs內(nèi)炎癥反應(yīng)及免疫細(xì)胞招募的調(diào)控。在ECs中過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子家族中的KLF2和KLF4能促進(jìn)ECs中eNOS和血栓調(diào)節(jié)素的表達(dá)，使ECs呈現(xiàn)出一種抗炎表型[8]。Yoshida等[13]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Tie-Cre在內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞中特異性敲除KLF4能加重血管損傷后新生內(nèi)膜形成。KLF4能通過抑制NF-κB與黏附分子VCAM-1啟動(dòng)子的結(jié)合，減少ECs表達(dá)VCAM-1，從而抑制血管損傷后的免疫細(xì)胞浸潤。KLF2亦會(huì)以類似的方式抑制ECs細(xì)胞膜表面VCAM-1、E-selectin的表達(dá)，影響ECs招募中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞。此外，KLF11似乎能以負(fù)反饋的方式調(diào)節(jié)ECs炎癥反應(yīng)，用炎癥因子TNF-α和LPS刺激ECs炎誘發(fā)炎癥的同時(shí)也會(huì)增加ECs中KLF11的表達(dá)；而KLF11-/-小鼠表現(xiàn)出增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞的招募，誘發(fā)內(nèi)皮炎癥變化[14]。除直接調(diào)控ECs的炎癥反應(yīng)，KLFs也可能會(huì)通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞分化減輕血管損傷后的局部炎癥反應(yīng)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，KLF4能促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，在髓系細(xì)胞中敲除KLF4顯示出加重AS斑塊中的炎癥反應(yīng)[15]。

4 KLFs對(duì)VSMCs功能的調(diào)控

VSMCs是構(gòu)成動(dòng)脈血管中膜的主要細(xì)胞成分，通過調(diào)整自身的收縮與擴(kuò)張控制著動(dòng)脈的管徑、血壓、血流等特性。生理狀態(tài)下的VSMCs表現(xiàn)出很低的增殖和遷移能力，分泌較少的ECM，在轉(zhuǎn)錄因子SRF和輔助轉(zhuǎn)錄因子myocardin的調(diào)控下表達(dá)與VSMCs收縮功能相關(guān)的蛋白，如SM-MHC、α-actin、Sm22α等[5]，這種狀態(tài)下的VSMCs被稱為收縮型VSMCs。當(dāng)血管損傷或疾病使VSMCs暴露于Ox-LDL、炎癥因子、生長因子等刺激下，其會(huì)通過表型轉(zhuǎn)換成為具有更高增殖和遷移能力和分泌大量ECM的合成表型細(xì)胞，同時(shí)減少表達(dá)收縮功能蛋白[16]。這種代謝旺盛的合成表型VSMCs是構(gòu)建新生內(nèi)膜的關(guān)鍵，因此調(diào)控血管損傷后VSMCs的異?；顒?dòng)對(duì)新生內(nèi)膜形成具有重要意義。

4.1 KLFs與VSMCs表型轉(zhuǎn)換 KLF4通常主要表達(dá)在胃腸上皮組織中，在完整血管的VSMCs中表達(dá)量很低，但在血管受到損傷后的短期內(nèi)，VSMCs內(nèi)KLF4的mRNA和蛋白水平能快速升高。PDGF是一種經(jīng)典的誘導(dǎo)VSMCs增殖、減少收縮marker基因表達(dá)的生長因子。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)，VSMCs中KLF4的mRNA會(huì)在PDGF作用45 min后達(dá)到最高值，用siRNA沉默KLF4能部分抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs收縮Marker基因表達(dá)。Laura等[18]用譜系追蹤技術(shù)分析AS斑塊中平滑肌細(xì)胞樣細(xì)胞(SLC)的來源，結(jié)果顯示VSMCs中特異性敲除KLF4能抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)換并提升AS斑塊及纖維帽中SLC的含量。研究顯示，KLF4能通過多種途徑參與調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)換過程。一方面KLF4能直接與SM-MHC、α-actin、Sm22α等VSMCs收縮表型的Marker基因啟動(dòng)子區(qū)域的G/C抑制元件結(jié)合，抑制VSMCs收縮功能相關(guān)基因的表達(dá)。另一方面，KLF4能通過抑制SRF與SM-MHC、α-actin、Sm22α等基因啟動(dòng)子區(qū)域的CArG元件結(jié)合，或抑制輔助轉(zhuǎn)錄因子myocardin的表達(dá)，間接性地調(diào)控VSMCs收縮型的marker基因[19]。KLF4還是骨形成蛋白-2,-4,-6和TGF-β1的下游分子，后者通過誘導(dǎo)miRNA-143/145表達(dá)減少KLF4的mRNA水平，維持VSMCs的收縮表型[20]。此外，與KLF4的作用相似，VSMCs中KLF5和KLF15的含量也在血管損傷后增加，主要表現(xiàn)出促VSMCs增殖和表型轉(zhuǎn)換作用。KLF5和KLF8能通過抑制α-SMA和Sm22α的啟動(dòng)子活性，間接性地阻斷血管緊張素Ⅱ引起的VSMCs收縮[21]。

4.2 KLFs與VSMCs增殖 KLF4是抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的重要轉(zhuǎn)錄因子，在腸道黏膜組織中或細(xì)胞受到輻射損傷后，KLF4能促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p53與p21的啟動(dòng)子結(jié)合，通過提高p21的表達(dá)阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。Yoshida等[22]發(fā)現(xiàn)，在VSMCs中KLF4亦通過相似的方式抑制內(nèi)皮損傷后VSMCs增殖，加重血管損傷后新生內(nèi)膜的形成。此外，有研究提出KLF4誘導(dǎo)p21表達(dá)的作用能被小泛素化修飾逆轉(zhuǎn)。用PDGF在誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)換和KLF4表達(dá)的同時(shí)，還能促進(jìn)KLF4與小泛素化修飾中的關(guān)鍵酶Ubc9結(jié)合，促進(jìn)KLF4的小泛素化修飾過程。小泛素化KLF4招募部分輔阻遏物如NCoR和HDAC2到p21的啟動(dòng)子，抑制p21的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出促進(jìn)VSMCs增殖的作用[23]。與KL4相似，KLF5亦主要以p21依賴的方式參與調(diào)控VSMCs增殖。KLF5可以通過抑制p21的表達(dá)阻斷血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)程。另外，Ang Ⅱ可通過ERK-MAPK通路激活KLF5的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)KLF5與c-Jun結(jié)合增加細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)，最終引起VSMCs的增殖。在非VSMCs細(xì)胞中，亦有研究發(fā)現(xiàn)KLF6、KLF8能與Cyclin D1的啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞周期。這些KLFs可能以相同方式調(diào)控VSMCs的增殖，參與新生內(nèi)膜的形成，不過此有待在動(dòng)物體內(nèi)和VSMCs上進(jìn)行驗(yàn)證。

5 未來研究展望

目前,針對(duì)血管內(nèi)膜增生尚無有效的預(yù)防和治療辦法，在臨床中常采用藥物洗脫支架緩解血管植入支架后的二次狹窄，但仍不能完全解決這一問題。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)miRNA家族多個(gè)成員如miRNA143/145能通過抑制KLF4的表達(dá)抑制新生內(nèi)膜，同時(shí)部分小分子化合物如ATRA能抑制KLF4在Sm22α啟動(dòng)子上的結(jié)合抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)換和增殖。這些研究均提示以KLFs為靶點(diǎn)治療新生內(nèi)膜的潛在可行性。然而，KLFs家族成員在在不同組織和細(xì)胞中表達(dá)的種類和功能都不盡相同，在新生內(nèi)膜形成過程中，同一KLF在ECs和VSMCs中可能發(fā)揮完全相反的效果，如KLF4能維持ECs的抗炎表型，而在血管損傷后的VSMCs中促進(jìn)VSMCs表型轉(zhuǎn)換。在開發(fā)以單個(gè)KLFs為治療新生內(nèi)膜的靶點(diǎn)時(shí)，應(yīng)該注意KLFs生物學(xué)功能的組織特異性。此外，當(dāng)前對(duì)KLFs家族在新生內(nèi)膜中的生物功能還缺乏系統(tǒng)性地認(rèn)識(shí)，除本文涉及的主要幾種KLFs外，KLFs家族其他成員在內(nèi)膜增生中的作用還尚不明確，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)不同KLFs之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)或協(xié)同作用，此可能會(huì)削弱以單個(gè)KLF為治療靶點(diǎn)的治療效果。KLFs家族在新生內(nèi)膜中的作用還需進(jìn)一步研究和揭示，這將更有助于開發(fā)以KLFs或KLFs相關(guān)信號(hào)通路為靶點(diǎn)的治療策略。