高效液相色譜法檢測茶葉中摻雜蔗糖的含量

韓蓉?周丹

本文用反相高效液相色譜檢測茶葉中蔗糖的含量，將茶葉中的蔗糖用純水提取，離心，通過0.45μm的濾膜過濾脫氣，流動相為水和乙腈（30：70），流速為1.0mL/min，色譜條件為ZORBAX Carbohydrate;色譜柱4.6mm×250mm，粒度5μm;柱溫40℃;示差折光檢測器。采用標準曲線法，得到的標曲曲線線性關系良好，適合于茶葉中蔗糖的檢測。

茶葉味苦、甘，微寒，入心、肺、脾經(jīng)。茶葉有清熱降火、祛風解暑的作用。治療外感風寒引起的頭痛、鼻塞，可以用茶葉跟生姜、白芷配伍[1]。風熱上擾引起的頭目昏痛，可用茶葉跟川芎、薄荷配伍。中暑引起的頭痛、煩躁、口渴，可以用茶葉跟西瓜皮同用。茶葉還有解毒、止瀉痢的作用，對于急性細菌性痢疾、慢性細菌性痢疾的急性發(fā)作，可以把茶葉研磨沖服。急性腹瀉、下痢不止，可以把茶葉和生姜水煎服。痔瘡出血，可以把茶葉炒焦存性，米湯送服。

近年來，蔗糖添加在茶葉（特別是紅茶）生產(chǎn)中時有發(fā)生[2]。茶葉加工中所添加的蔗糖一方面可在香氣、色澤等方面影響對成茶的感官品質(zhì)評判;同時，由于蔗糖易吸潮、易變質(zhì)和易滋生細菌等特點，對茶葉質(zhì)量安全有較大的影響。目前，對于基質(zhì)簡單的食品中糖類成分樣品檢測可選方法相對較多;但對于基質(zhì)較復雜的食品（如茶葉等）樣品中的蔗糖檢測，由于基質(zhì)復雜，直接檢測干擾太多，很難直接檢測出蔗糖含量，一般需先分離干擾基質(zhì)再檢測，多采用液相色譜法。茶葉中含有各種糖類，是構(gòu)成茶葉滋味的重要成分之一[3]。在進行茶葉加工的過程中，糖類發(fā)生非酶促褐變作用，生成醛和吡咯，對形成茶葉的色澤和香氣有重要影響。部分可溶性糖是影響茶湯是否醇正的主要影響因素?！妒称分羞€原糖的測定方法》等文章介紹了檢測分析糖類的成分的幾種方法，這些方法存在一定的弊端，如時間長，定量測定不準，耗時耗力，無法自動化操作，實驗儀器昂貴使用不便等。隨著我國定量分析測定技術的提升，高效液相色譜法（HPLC）發(fā)展成為糖類檢測中最有效的方法[4]，能將多種糖類逐一分離進行分析，能將物質(zhì)中糖類含量準確地進行定性定量分析，成為糖類分析最重要最準確的方法之一。目前我國已廣泛使用高效液相色譜法（HPLC）分析食品中的糖類。

1.材料與方法

1.1儀器

高效液相色譜儀LC1260 安捷倫科技有限公司，示差折光檢測器 安捷倫科技有限公司，ZORBAX Carbohydrate柱 4.6mm×250mm.粒度5um，默克密理博純水機，美國貝克曼離心機，超聲脫氣機，梅特勒電子天平

1.2試劑

蔗糖標準品、乙腈、蒸餾水

1.3 實驗材料

市售茶葉

1.4色譜柱的前處理

用已配制好的水和乙腈（30：70）緩沖溶液過0.45μm的濾膜超聲處理之后脫氣，以1.000mL/min的流速洗柱12h 保持柱溫40℃。

1.5 色譜條件

流動相：水和乙腈（30：70），流速為1.0mL/min

色譜柱：ZORBAX Carbohydrate柱 4.6mm×250mm.粒度5μm，柱溫40℃

示差折光檢測器

進樣量：20μL。

1.6標準樣品的配制

1.6.1蔗糖標準儲備液（20mg/mL）：

稱取蔗糖標準品0.2g（精確至0.0001g）于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，濃度為20mg/mL，有效期一個月，4℃冰箱保存。

1.6.2蔗糖標準使用液：

分別吸取蔗糖標準儲備液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.5mL、5mL于50mL容量瓶中，用水定容。分別相當于：0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL濃度標準溶液。分別進標準溶使用液系列各20μL，進行HPLC分析，然后以峰面積為縱坐標，蔗糖的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，化學工作站完成，建立校正表[5]。

1.6 樣品前處理及檢測

取市售茶葉5g加20mL水，超聲30min，靜置，待冷卻后取上清液于離心管中，以4000r/min離心10分鐘，取上清液于50mL容量瓶中，重復一遍，合并上清液。然后用0.45μm濾膜過濾后脫氣待測。取蔗糖樣品20μL進樣檢測峰面積。

2.結(jié)果與分析

2.1 線性回歸方程和檢出限

通過對標準樣品和茶葉樣品的進樣，得標準樣品色譜圖，標準曲線圖和茶葉樣品色譜圖。其中，檢測限是分析物蔗糖的信噪比為 3（S/N=3）時所對應的濃度。結(jié)果表明，蔗糖的檢測線性回歸方程的相關性良好，檢出限為 0.10 g/100 g。

其中Y為峰面積，X為濃度（mg/mL） 將樣品峰面積Y代入公式求X，可以得到茶葉中蔗糖的濃度C。

2.2結(jié)果計算

X=c×V/（m×10）

式中：

X---試樣中蔗糖的含量，單位（g/100g）;

c---由標準曲線查的試樣進樣液中蔗糖的濃度，單位（mg/mL）;

V---試樣定容體積，單位（mL）;m---試樣質(zhì)量，單位（g）;10---換算系數(shù)。

結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

如圖所示，疑似摻糖茶葉蔗糖含量為1.918g/100g，自制摻糖茶葉蔗糖含量為2.303g/100g，秀水天香茶葉蔗糖含量為0.378g/100g，武當山茶葉蔗糖含量為0.377g/100g。其中自制茶葉加糖前后蔗糖含量對比明顯。秀水天香茶葉與武當山茶葉受海拔、土壤、光照及降水[6]等種植條件的影響，蔗糖含量明顯高于自制茶葉。

2.3回收率實驗

以秀水天香綠茶為綠茶的基質(zhì)，在最優(yōu)條件下進行 3 個水平的加標回收試驗，每個

水平重復 6 次，按 1.6 方法處理，加標結(jié)果分別見表 4。結(jié)果表明，蔗糖的回收率在 87.9 %～98.6 %之間，RSD %在 1.33 %～2.14 %之間。

3討論

3.1流動相及流速的選擇

水和乙腈（30：70）體系對蔗糖有較好的溶解度和選擇性，和別的雜質(zhì)有較好的分離度。選擇流速時，對峰形對稱性有影響[7]，由于液相色譜的柱長250mm，柱徑4.6mm已經(jīng)確定，就須選擇與之柱子匹配的流量，一般對于250mm、4.6mm、5μm的填料最佳流量為1.000mg/min。

3.2色譜柱的選擇

本次實驗采用安捷倫ZORBAX Carbohydrate 糖分析專用柱。糖分析柱具有重現(xiàn)性好、高效和使用靈活的特點。 每一批這種特殊用途的氨基丙基柱填料都要經(jīng)過分離單糖和二聚糖的測試。這個色譜柱采用ZORBAX多孔硅膠微球技術[8]。糖分析柱可進行大體積進樣，4.6 x 150 mm色譜柱可以進樣50 μL。

3.3適宜溫度

實際分析中改變柱溫對液相色譜的分離選擇性，分離速度，流動相黏度，柱前壓等均會產(chǎn)生影響。色譜柱溫太高，流動相黏度降低，有利于增大柱的通透性，可加快分析速度，可在一定程度上提供分離選擇性，但是會降低色譜柱的使用壽命，一般設置溫度為室溫，本實驗設置溫度為40°

3.4 定性定量方法

以保留時間進行定性，通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰[9]，來確定試樣中是否含有蔗糖及在色譜圖中的保留位置。此實驗用外標法進行定量，在一定的色譜條件下，檢測器的響應信號，即色譜圖上的峰面積與進入檢測器的濃度成正比，這是蔗糖定量的基礎，對樣品進行定量有歸一化法，外標法和內(nèi)標法;歸一化法要求對樣品中所有組分全部出峰，由于該方法使用的標準試劑是分析純，含有的雜質(zhì)較多，有歸一化法定量將產(chǎn)生較大的誤差。內(nèi)標法的準確度較高，但對于每個試樣的分析，都要先進行2次稱量[10]，不適合大批量樣品的快速分析。外標法配置一系列標準溶液進行色譜分析，外標法不使用校正因子，準確度較高，但操作條件變化對準確性影響較大，適用大批量試樣的快速分析，因此本實驗采用外標法進行定量。

3.5 注意事項

由于流動相是分析純其中雜質(zhì)較多[11]，使一些譜圖出現(xiàn)前伸峰;柱溫的不穩(wěn)定這些因素導致蔗糖的保留時間有所差別，在精度要求的范圍內(nèi)均影響不大。本實驗采用外標法[12]進行定量，確定了RP—HPLC與其它物質(zhì)的最佳分離條件，此方法準確度較高適用于大批量試樣的快速分析，適合于茶葉中蔗糖含量的測定[13]。

3.6 結(jié)論

利用本實驗方法，對本地綠茶100批次的檢測，得出蔗糖含量在5%～1%之間的樣品，為可疑摻糖樣品，含量在1%以上的，可以基本確定摻雜了蔗糖。

參考文獻

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