硬枝黃蟬乙醇提取物中抑制胡椒瘟病菌活性成分研究

茍亞峰 胡林峰 曾煊

摘要 為研究硬枝黃蟬Allemanda neriifolia Hook.乙醇提取物的抑菌活性，本研究采用減壓柱層析、薄層色譜等對其乙醇提取物的抑菌成分進(jìn)行了初步分離，以胡椒瘟病菌Phytophthora capsici為供試病原菌，測定了不同餾分對胡椒瘟病菌的抑菌活性。結(jié)果表明，石油醚萃取組分（AN-LS1）、氯仿萃取組分（AN-LS2）、乙酸乙酯萃取組分（AN-LS3）對胡椒瘟病菌均具有一定抑菌活性，抑制率分別為69.59%、66.73%和15.10%。對3種萃取組分采用活性跟蹤分離，發(fā)現(xiàn)餾分AN-LS1-05、AN-LS1-06、AN-LS2-03、AN-LS2-04、AN-LS2-05、AN-LS3-02、AN-LS3-03對胡椒瘟病菌抑制率達(dá)到了100%，餾分AN-LS2-06、AN-LS2-07和AN-LS3-04抑制率達(dá)到了80%。對各餾分進(jìn)一步分離最終得到AN-LS1-05-04、AN-LS1-07-07、AN-LS2-04-04、AN-LS2-06-05-06、AN-LS3-04-06等16個化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步鑒定。

關(guān)鍵詞 硬枝黃蟬; 胡椒瘟病菌; 抑菌活性; 餾分

中圖分類號： S 435.73

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019514

Abstract In order to investigate the inhibitory activity of ethanol extract from Allemanda neriifolia Hook.， the inhibitory components was separated from the ethanol extract by pressure reducing column chromatography and TLC method with Phytophthora capsici as tested pathogen. The result showed that petroleum ether （AN-LS1）， chloroform （AN-LS2） and acetic ether extraction （AN-LS3） had certain inhibitory activity， with the inhibition ratios of 69.59%， 66.73% and 15.10%， respectively. By active tracking separation of the three extraction components， AN-LS1-05， AN-LS1-06， AN-LS2-03， AN-LS2-04， AN-LS2-05， AN-LS3-02 and AN-LS3-03 were found to exhibit high inhibition ratio of 100%， Besides， the inhibition ratios of other three fractions （AN-LS2-06，AN-LS2-07 and AN-LS3-04） reached 80%. The 16 components were separated， such as AN-LS1-05-04， AN-LS1-07-07， AN-LS2-04-04， AN-LS2-06-05-06， AN-LS3-04-06 and so on， and their chemical structures remain to be further identified.

Key words Allemanda neriifolia; Phytophthora capsici; inhibitory activity; fraction

胡椒Piper nigrum Linn.在世界上各種香料中占有主導(dǎo)地位，在歐洲和北美等國家都有食用。胡椒瘟病是世界各胡椒生產(chǎn)地區(qū)最重要的病害，由疫霉Phytophthora capsici侵染引起的一種傳染力很強(qiáng)的土傳病害，常在雨季發(fā)生。海南自引種種植以來，該病就一直是危害胡椒生產(chǎn)的首要病害，最嚴(yán)重的胡椒園損失可達(dá)90%以上[1]。國內(nèi)劉進(jìn)平等和邢谷揚(yáng)綜述了胡椒瘟病的化學(xué)防治技術(shù)[2-3]。國外Kasim研究了甲霜靈、疫霜靈等對胡椒瘟病的室內(nèi)和大田防治效果[4]。Anandaraj等關(guān)于印楝、飛機(jī)草等植物提取液對胡椒瘟病病原菌抑制效果的研究發(fā)現(xiàn)，0.2%的飛機(jī)草提取液具有較好的抑制作用[5]。Ezziyyani等利用哈茨木霉Trichoderma harzianum和婁徹氏鏈霉菌Streptomyces rochei對胡椒瘟病進(jìn)行了生物防治研究[6]。

硬枝黃蟬Allemanda neriifolia Hook.是夾竹桃科Apocynaceae黃蟬屬Allemanda植物，常綠灌木，原產(chǎn)巴西，中國亞熱帶地區(qū)的廣東、福建、廣西、臺灣等地有引種，現(xiàn)廣泛栽培于熱帶地區(qū)，為觀賞植物[7]。林同等[8]研究發(fā)現(xiàn)硬枝黃蟬花的乙醇提取物對白蟻具有一定防治效果，馮崗等[9]、張靜等[10]研究發(fā)現(xiàn)軟枝黃蟬提取物對螺旋粉虱成蟲、椰心葉甲具有一定毒殺活性。茍亞峰等[11]對23種熱帶植物抑菌活性篩選中發(fā)現(xiàn)蔓馬纓丹等對胡椒瘟病菌具有較好抑菌活性。因此，本試驗(yàn)以胡椒瘟病菌為供試病原菌，采用活性跟蹤法[12]分離硬枝黃蟬乙醇提取物中對胡椒瘟病菌具有抑菌活性的成分，為進(jìn)一步研制防治胡椒瘟病的植物源殺菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物提取物

硬枝黃蟬Allemanda neriifolia Hook.枝葉采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所內(nèi)。將新鮮的硬枝黃蟬枝葉充分陰干，粉碎后過40目篩。采用冷浸法加入干粉5倍量的乙醇分別浸提24、48、72 h，過濾，合并3次濾液并減壓濃縮，獲得硬枝黃蟬乙醇提取物浸膏，備用。

1.1.2 供試病原菌

胡椒瘟病菌Phytophthora capsici由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所病蟲害防控研究室分離提供，接種于PDA培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 萃取組分的制備方法

參照茍亞峰等[13]方法，稱取硬枝黃蟬枝葉提取物浸膏20 g溶于10倍量的去離子水中，制成懸浮液，再依次用10倍量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次分別萃取3次，合并各溶劑萃取液并減壓濃縮，冷凍干燥除去溶劑分別得到石油醚萃取組分（AN-LS1）、氯仿萃取組分（AN-LS2）、乙酸乙酯萃取組分（AN-LS3）、正丁醇萃取組分（AN-LS4）、水相（AN-LS5），備用。

1.2.2 抗菌活性測定方法

采用菌絲生長速率法[14]測定抑菌活性。用移液槍取1 mL配制好的藥液，加入到20 mL滅菌刻度試管中，再加入PDA培養(yǎng)基定容至10 mL，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻。用滅菌打孔器（內(nèi)徑4 mm）在生長有菌絲的培養(yǎng)皿上打取菌餅，然后用接種針將菌餅接到帶藥PDA平板中心。每種藥液做3個重復(fù)，以溶劑作對照，放25℃恒溫條件下培養(yǎng)。5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，記錄數(shù)據(jù)并按以下公式計(jì)算抑制率：

1.2.3 抑菌活性成分分離方法

稱取不同溶劑萃取組分，用有機(jī)溶劑溶解，加入0.5倍量100～200目的硅膠，攪拌均勻，放置于燒杯中晾干成粉末狀樣品，采用減壓柱層析干法裝柱。根據(jù)薄層色譜（TLC）分離情況，選擇洗脫劑分別進(jìn)行洗脫。每次洗脫加入洗脫劑200 mL，抽干后進(jìn)行下一次洗脫，各洗脫餾分采用TLC展板對比，合并相近餾分，測定抑菌活性，對抑菌活性較高的餾分重復(fù)上述步驟繼續(xù)進(jìn)行分離。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件中Duncan氏新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及各組處理數(shù)據(jù)間的顯著性分析和比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 AN-LS各萃取組分抑菌活性測定

從硬枝黃蟬乙醇提取物AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3、AN-LS4、AN-LS5 5個萃取組分抑菌活性測定結(jié)果（表1）可以看出，不同極性有機(jī)溶劑萃取硬枝黃蟬乙醇提取物后各萃取組分對胡椒瘟病菌的抑菌活性不同，其中抑菌活性主要集中在AN-LS1和AN-LS2中，AN-LS3抑菌活性次之。

2.2 AN-LS各萃取組分抑菌活性成分分離

對抑菌活性較強(qiáng)的AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3萃取組分分別進(jìn)行分離。AN-LS1分離后共獲得AN-LS1-01～AN-LS1-12 12個餾分。AN-LS2分離后共獲得AN-LS2-01～AN-LS2-10 10個餾分。AN-LS3分離后共獲得AN-LS3-01～AN-LS3-10 10個餾分。

2.3 AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3各餾分抑菌活性測定

對AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3各餾分抑菌活性進(jìn)行測定，結(jié)果見表2～4。

3 討論

從硬枝黃蟬乙醇提取物石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取組分對胡椒瘟病菌抑菌活性測定結(jié)果可以看出，石油醚、氯仿萃取組分對胡椒瘟病菌的抑菌活性達(dá)到了50%以上，乙酸乙酯萃取組分抑菌率僅為15.10%，但對這3種萃取組分進(jìn)一步分離時發(fā)現(xiàn)，餾分AN-LS1-05、AN-LS1-06、AN-LS2-03、AN-LS2-04、AN-LS2-05、AN-LS3-02、AN-LS3-03對胡椒瘟病菌抑菌活性均達(dá)到了100%，由此可以推斷硬枝黃蟬乙醇提取物中對胡椒瘟病菌抑菌活性成分有富集的現(xiàn)象，具體分離的16種化合物對胡椒瘟病菌的抑菌活性有待進(jìn)一步研究。植物源農(nóng)藥的有效成分是植物體中的次生代謝產(chǎn)物，具有環(huán)境友好、對非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性、作用方式特異、促進(jìn)作物生長并提高抗病性等特點(diǎn)，從植物中分離純化具有農(nóng)藥活性的新物質(zhì)，以此先導(dǎo)化合物為結(jié)構(gòu)模板，進(jìn)行結(jié)構(gòu)的多級優(yōu)化，創(chuàng)制高效低毒新農(nóng)藥是植物農(nóng)藥的研究重點(diǎn)[15]。目前，進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)的像苦參堿、印楝素、魚藤酮等植物源生物農(nóng)藥在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用使植物源生物農(nóng)藥的推廣有了長足的進(jìn)步[16]。下一步將對硬枝黃蟬乙醇提取物中分離的16種化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，有望為開發(fā)新的防治胡椒瘟病的植物源殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 桑利偉， 劉愛勤，譚樂和，等.海南省胡椒瘟病病原鑒定及發(fā)生規(guī)律[J].植物保護(hù)，2011，37（6）：168-171.

[2] 劉進(jìn)平，鄭成木，鄭服叢.胡椒瘟病與辣椒疫霉[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（5）：27-31.

[3] 邢谷楊.胡椒無公害生產(chǎn)及其主要病蟲害防治[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2004（6）：34-35.

[4] KASIM R.The control of foot rot disease of pepper caused by Phytophthora palmivora using fungicides [J].Edisi Khusus Penelitian Tanaman Rempah Dan Obat，1986，11（2）：63-66.

[5] ANANDARAJ M，LEELA N K. Toxic effect of some plant extracts on Phytophthora capsici， the foot rot pathogen of black pepper [J].Indian Phytopathology，1996，49（2）：181-184.

[6] EZZIYYANI M，REQUENA M E，EGEA-GILABERT C， et al. Biological control of Phytophthora root rot of pepper using Trichoderma harzianum and Streptomyces rochei in combination [J].Journal of Phytopathology，2007，155（6）：342-349.

[7] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第六十三卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1977：73-78.

[8] 林同，陸寧將，樊緒富，等.黃蟬和駁骨丹對橄欖星室木虱的毒殺活性[J].中國森林病蟲，2006，25（5）：41-42.

[9] 馮崗，閆超，張靜.軟枝黃蟬提取物對螺旋粉虱的殺蟲活性[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，33（7）：54-57.

[10]張靜，馮崗.軟枝黃蟬提取物對椰心葉甲的殺蟲活性[J].熱帶作物學(xué)報，2010，31（7）：1152-1156.

[11]茍亞峰，劉愛勤，孫世偉，等.23種植物提取物對胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J].植物保護(hù)，2010，36（6）：128-131.

[12]楊震發(fā)，袁呈山，楊順義，等.黃花棘豆抑制植物病原菌的活性成分研究[J].植物保護(hù)， 2014， 40（6）：59-64.

[13]茍亞峰，孫世偉，高圣風(fēng)，等.圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同萃取組分對胡椒瘟病菌的抑菌活性測定[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，34（4）：60-62.

[14]吳文君.植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)導(dǎo)論[M].西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1988.

[15]何軍，馬志卿，張興.植物源農(nóng)藥概述[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，34（9）：79-85.

[16]邱德文.生物農(nóng)藥—未來農(nóng)藥發(fā)展的新趨勢[J].中國農(nóng)村科技，2017（11）：36-39.

（責(zé)任編輯：楊明麗）